河曲马源大肠杆菌耐药相关基因检测及外排泵抑制剂对其生物被膜的影响

[目的]了解河曲马源大肠杆菌的耐药情况,为兽医临床合理使用抗菌药物提供基础理论指导。[方法]采用细菌形态学、革兰染色镜检、16S rDNA序列分析等方法进行细菌分离鉴定。采用微量肉汤稀释法和PCR扩增方法对分离鉴定的大肠杆菌进行抗菌药物敏感性试验及耐药基因、整合酶基因、外排泵基因携带情况检测。同时,采用改良结晶紫半定量方法进行生物被膜形成能力测定。利用棋盘法测定13种外排泵抑制剂与多西环素联用对生物被膜的清除作用。[结果]分离株在伊红-美蓝琼脂培养基上为具有绿色金属光泽的紫黑色菌落,在大肠杆菌/大肠菌群显色培养基上为蓝色菌落,革兰染色镜检可见粉红色短杆状细菌。经16S rDNA测序比对与大肠杆菌高度相似的分离株为64株。64株大肠杆菌分离株对酰氨醇类、磺胺类及利福霉素类药物耐药率相对较高并出现多重耐药菌株,其中20.31%(13/64)表现出对5类抗菌药物耐药;检测到21个耐药基因、1个整合酶基因及6个外排泵基因为阳性;整合酶基因intl 1检出率为89.06%。生物被膜形成能力为强、中、弱及无成膜能力的大肠杆菌分别为8(12.50%)、34(53.13%)、20(31.25%)和2(3.12%)株。外排泵抑制剂与多西环素联合能增强对生物被膜的清除能力。[结论]河曲马源大肠杆菌耐药较为严重,应进一步加强青海省河南蒙古族自治县赛马的用药监管力度,减少或避免多重耐药菌株的出现及耐药性广泛传播。

阿米卡星诱导对大肠埃希氏菌耐药性及生物被膜和外排泵活性的影响

为研究亚抑菌浓度阿米卡星诱导对大肠埃希氏菌敏感菌株耐药性、生物被膜形成能力及外排泵活性的影响,采用微量肉汤稀释法测定阿米卡星对6株菌株的最小抑菌浓度(MIC),并以0.5 MIC作为初始诱导浓度进行诱导,每隔5 d重新测定阿米卡星MIC,并调整诱导浓度,共计30 d,最后将诱导第30天菌株进行无药物压力稳定培养5 d,保存各诱导菌株及无药传代菌株共计210株,测定各诱导菌株药物敏感性、生物被膜形成能力及部分菌株外排泵活性变化。结果发现,随着诱导天数的增加,阿米卡星对6株分离菌株MIC逐渐升高,诱导菌株耐药性不断增强,其对诱导第30天菌株的MIC值为诱导前的8~32倍;经过5 d无药培养后,MIC测定结果与第30天基本保持一致;诱导后的菌株中,强成膜能力菌株占总数的5%,中成膜能力菌株为56.7%;以每5 d的生物被膜形成量平均值与原菌相比,结果发现,所有诱导菌株生物被膜形成量均显著增加(P<0.01),表明亚抑菌浓度阿米卡星诱导可促进大肠埃希氏菌生物被膜的形成;无药稳定培养5 d的菌株与诱导第30天菌株相比,生物被膜形成能力基本保持不变。荧光探针测定外排泵结果显示,诱导菌株外排泵活性显著受到抑制。以上研究结果表明,阿米卡星诱导促进菌株生物被膜的形成,抑制外排泵活性,使菌株的耐药性增强,研究结果可为氨基糖苷类药物用药提供理论依据。

细菌外排泵功能及抑制机制的研究进展

近年来,由于抗生素在临床上的不规范使用,细菌耐药率呈快速增长趋势,显著增加临床的抗感染治疗难度。对于耐药菌而言,外排蛋白基因占所有转运蛋白基因的6%~18%。因此,由外排基因编码的外排泵是细菌产生多重耐药的重要机制之一。最新研究结果表明,外排泵抑制剂是通过抑制外排泵研发针对性抗生素的新治疗靶点,因此,为解决细菌多重耐药性问题,研发外排泵抑制剂势在必行。鉴于此,本研究对细菌外排泵的功能和抑制机制进行综述,以期为临床合理用药及医院感染防控提供帮助与指导。

穿心莲内酯对金黄色葡萄球菌外排系统的抑制作用

为探究穿心莲内酯(AP)对金黄色葡萄球菌(S.aureus)外排系统的抑制作用,本试验采用微量肉汤稀释法和棋盘法检测AP与抗菌药物的联合抑菌作用,荧光分光光度法检测AP对S.aureus体内环丙沙星蓄积量的影响,PCR和实时荧光定量PCR方法检测S.aureus外排泵基因的携带情况和AP对S.aureus外排泵基因转录水平的影响。结果显示,AP与环丙沙星具有协同作用;AP与S.aureus作用12 min时,能极显著提高菌体内环丙沙星的蓄积量(P<0.000 1);外排泵基因norA、norB、norC、sepA、mepA和mdeA同时携带的比例为24.1%,norB基因的检出率最高,为87.4%;AP作用后,S.aureus外排泵基因转录水平均极显著下降(P<0.001或P<0.000 1),其中norB在AP浓度达到256和512μg/mL时下降幅度最大,较空白对照降低91%(P<0.001),提示AP可通过抑制外排泵基因的表达来增强S.aureus对药物的敏感性。本试验从耐药表型和基因表达水平来确认AP是否可成为一种潜在的外排泵抑制剂,为解决S.aureus耐药问题提供新的思路。

耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌生物膜形成与外排泵基因AdeABC表达的相关性研究

目的 研究鲍曼不动杆菌的生物膜形成,以及浮游态和生物膜状态下对外排泵基因AdeABC的相对表达量作用于碳青霉烯类抗生素耐药机制的影响。方法 将菌株经药物敏感性试验分为碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(CRAB)组和碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆菌(CSAB)组,采用结晶紫染色法检测两组生物膜形成能力;通过微量肉汤稀释法分别测定两组对亚胺培南的MIC、MBIC值,并计算MBIC/MIC的比值进一步比较分析生物膜菌和浮游菌的耐药性;同时提取CRAB组浮游态和生物膜态的RNA,通过RT-qPCR检测外排泵基因AdeABC相对表达量。结果 35株标本的生物膜阳性率为91.43%,其中CRAB组生物膜的阳性检出率为92%,生物膜阴性、弱阳性、阳性和强阳性分别占8%、48%、36%和8%。MBIC/MIC比值显示,形成生物膜后,鲍曼不动杆菌的耐药能力呈现不同程度的增加,CSAB组的耐药增加幅度以2倍的菌株最多;CRAB组的增加幅度以4倍的菌株最多。同时CRAB组RT-qPCR结果显示,生物膜较浮游态相比,外排泵基因adeA和adeB的相对表达量明显增高(P<0.01),外排泵基因adeC相对表达量则无差异(P>0.05)。结论 鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药与生物膜密切相关,且生物膜态的鲍曼不动杆菌较浮游态可促进外排泵基因AdeABC的表达从而增强碳青霉烯类抗生素的耐药性。

氯己定与抗生素耐药性相关性的研究进展

抗生素耐药性是全球人类公共健康领域的巨大危机,影响生命安全并给社会带来巨大的经济负担。氯己定(chlorhexidine,CHX)是临床最为常用的消毒剂之一。目前已有大量研究发现,CHX应用与抗生素耐药性密切相关。一方面,已有研究证实CHX可诱导多种重要的院内感染病原菌发生抗生素交叉耐药,甚至出现对最后一线抗生素的耐药性;另一方面,CHX与抗生素可能存在共耐药。主动外排泵的过度表达及细胞膜的相关改变是CHX与抗生素耐药性相关性中的重要机制。然而,CHX被广泛无限制地应用于临床领域,其潜在风险被严重低估。因此,本文将回顾CHX与抗生素耐药性的相关性及其相关机制,以提高CHX临床应用的警示。

氯己定在口腔细菌中敏感性下降及其相关机制的研究进展

氯己定(chlorhexidine,CHX)被广泛应用于医疗领域的表面消毒,然而其应用缺乏临床限制。其长期广泛应用已导致多种重要的院内感染病原体临床分离菌株出现CHX敏感性下降,并可产生对一系列关键抗生素的交叉耐药。然而,CHX已在口腔领域作为金标准应用超过50年,其在口腔细菌中的耐药风险却未被重视。因此,本文旨在回顾CHX在口腔细菌中敏感性下降的研究进展并对其相关机制进行阐述,引发口腔领域对于CHX应用潜在风险的关注。

临床分离株鲍曼不动杆菌耐药性与AdeABC及AdeIJK外排泵基因表达相关性研究

目的 分析鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, A.baumannii)感染病人分离的A.baumannii外排泵相关基因的携带情况,探讨其与抗生素的耐药之间的关联,为医院感染防控及临床合理用药提供实验依据。方法 选择2022年1月—2023年9月本院收治的感染A.baumannii的住院患者作为研究对象,共分离A.baumannii菌株55株,采用real-time PCR技术对A.baumannii外排泵adeA、adeB、adeC、adeI、adeJ、adeK等基因表达水平进行检测;MIC法和K-B法检测各菌株的抗生素敏感性。按美国CLSI2023年版要求对各菌株进行抗生素敏感性判断。结果 与敏感组A.baumannii比较,不敏感组A.baumannii的adeA、adeB、adeC、adeJ基因表达较高,差异具有统计学意义(P<0.05);相对于敏感组,不敏感组adeB表达水平表达上调约3~30倍,差异具有统计学意义(P<0.05),adeJ表达水平表达上调约11~876倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 adeB和adeJ在本机构临床株鲍曼不动杆菌抗生素耐药中发挥一定的作用,但多种耐药机制可能参与调节鲍曼不动杆菌耐药,针对AdeABC和AdeIJK外排泵的深层次耐药机制以及其他耐药因素的分析仍需进一步探讨。

苦参碱逆转外排泵系统AcrAB-ToIC介导的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药性

目的评估苦参碱对由外排泵AcrAB-TolC介导的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对替加环素耐药的影响并探究其逆转耐药性的相关调控机制。方法使用棋盘稀释法,分别设置阴性对照组、阳性对照组、替加环素组、苦参碱组、联合用药组;培养24 h后,酶标仪测定吸光度,记录各药物组的最低抑菌浓度(MIC)、计算抑菌率和部分抑菌浓度指数(FIC);取各药物组MIC对应孔和阳性对照孔,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测AcrAB-TolC外排泵系统调控基因AcrB、MarA、RamA、AcrR的表达情况。结果与单用替加环素或苦参碱相比较,替加环素与苦参碱联合应用能更明显的抑制外排泵系统AcrAB-TolC介导的替加环素耐药的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的生长(P<0.05),替加环素与苦参碱的药理主要表现为协同或相加作用;联合用药下,替加环素与苦参碱的MIC值均明显降低,替加环素的MIC均能恢复至替加环素敏感MIC值;苦参碱单独或联合作用后,AcrAB-TolC外排泵RamA、AcrB表达明显降低(P<0.05),AcrR基因表达明显升高(P<0.05)。结论苦参碱能下调耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的AcrAB-Tolc外排泵调控蛋白RamA和AcrB基因的表达、及上调AcrR基因的表达,起到逆转替加环素耐药的作用。

多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵与外膜蛋白表达水平分析

目的分析鲍曼不动杆菌对常用抗生素的敏感性,检测外排泵基因和外膜蛋白基因的表达水平,探讨上述基因表达与抗生素耐药之间的关系。方法选择下呼吸道标本分离的鲍曼不动杆菌共213株,对其进行菌种鉴定、药敏试验;根据药敏试验将其分为不敏感组(NS组)与敏感组(S组),应用荧光定量PCR检测外排泵基因(adeB、adeJ、adeG、craA、abeM、amvA)、外膜蛋白基因(omp25、omp33-36、carO)的表达水平,比较上述基因在NS组与S组表达水平的差异。结果鲍曼不动杆菌对阿米卡星、亚胺培南不敏感率分别为89.2%、81.2%,对哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、庆大霉素等药物的不敏感率均超过92%。adeB基因相对表达量升高(RE≥1)在各抗生素(AMK、IPM、CFP、FEP、TZP、CAZ、SXT、CIP、SCF、CN)NS组的比例高于S组,差异有统计学意义(P<0.05)。外排泵adeB基因mRNA的RE值在上述各抗生素NS组和S组之间差异有统计学意义(P<0.05),NS组adeB基因的RE值平均水平较高。外排泵adeJ、adeG、craA、abeM、amvA基因平均RE水平无升高,且经比较分析差异无统计学意义(P>0.05)。外膜蛋白omp25、omp33-36、carO基因平均RE值均超过1.0,提示相对表达量升高。结论本院鲍曼不动杆菌对多种抗生素耐药率较高。外排泵基因adeB过度表达在本院鲍曼不动杆菌耐药中起着重要作用;其余外排泵基因adeJ、adeG、craA、abeM、amvA和外膜蛋白基因omp25、omp33-36、carO在本研究的多数菌株耐药机制中可能不起作用。

基于基因组学CRKP的RND外排泵分布及生物膜研究

目的探讨耐药结节细胞分化(RND)外排泵在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)中的分布情况及与生物膜形成的作用。方法收集该院临床分离的CRKP菌株,采用Whonet5.6软件分析其标本来源、科室分布等;采用生物膜形成试验观察不同培养时间生物膜形成情况;采用二代测序数据分析RND外排泵基因、耐药基因、分子分型等;采用PCR扩增RND外排泵基因。结果63株CRKP中87.3%来源于痰液,77.5%分离自重症监护室(ICU)。二代测序显示,多数菌株携带10余种耐药基因,55.6%菌株耐药基因与表型匹配;携带RND外排泵基因的61株菌株中,PCR扩增阳性23株(37.7%),荚膜血清型主要为KL64(95.7%);PCR扩增阴性38株(62.3%),荚膜血清型较分散,包括KL64(77.5%)、KL47(10.0%)、K50(7.5%)和K20(5.0%)这4种;24 h生物膜阳性31株(49.2%),36 h生物膜阳性48株(76.2%);RND阳性与阴性菌株的生物膜形成能力差异无统计学意义(P>0.05)。结论CRKP主要分离自ICU老年患者,多数菌株存在RND外排泵基因但未表达,与生物膜形成无明显相关,其在多重耐药中的作用有待进一步探讨。

耐替加环素鲍曼不动杆菌中外排泵AdeB与Bfs过表达生物膜形成的关系

目的研究生物内被膜相关基因和向外排水泵基因之间在对耐替加环素鲍曼不动杆菌抗性上的相互作用。方法根据替加环素药敏敏感试验,将72株临床分离的鲍曼不动杆菌分为耐替加环素鲍曼不动杆菌组和替加环素敏感鲍曼不动杆菌组。采用结晶紫染色法观察两株菌的生物被膜形成情况。用RT-PCR方法分析生物被膜相关基因和外排泵基因。结果耐替加环素组生物被膜形成率为82.2%,替加环素敏感组生物被膜形成率为14.8%。转录水平上,耐药组生物被膜合成基因BfmS阳性率明显高于敏感组(P<0.01)。替加环素的最小抑菌浓度生物被膜组明显高于生物被膜缺失组(P<0.01)。外排泵AdeB基因在生物被膜形成组阳性率为95.2%,生物被膜缺失组为38.7%。结论BfS基因和AdeB外排泵基因的共表达可能与鲍曼不动杆菌生物被膜的形成有关。AdeB与BfS转录水平的提高促进了生物膜的形成,从而提高了鲍曼不动杆菌对替加环素的抗性。

细菌耐药机制研究进展及新药研发策略

进入21世纪以来,由于抗生素的滥用导致了许多耐药细菌的产生,甚至出现了“超级细菌”,导致临床感染及抗生素经验性治疗失败。文章以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和鲍曼不动杆菌(AB)为例,从细菌的耐药现状、趋势及细菌耐药机制3个方面进行阐述,探讨中药治疗细菌性感染疾病的优势,讨论抗菌新药研发新策略,揭示菌株耐药的根本原理,以期找到逆转消除耐药性的方法,为未来细菌防治研究、中药治疗细菌性感染及抗菌新药研发提供新思路。

鲍曼不动杆菌在环境美罗培南浓度变化时耐药性的改变及其机制

目的探寻鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)在环境中碳青霉烯类药物美罗培南浓度改变时耐药性变化的机制。方法通过改变鲍曼不动杆菌标准敏感株ATCC19606和临床耐药株AB.2014培养环境中的美罗培南浓度等条件,诱导对美罗培南不同耐药程度的衍生株。测量所得菌株的生长曲线,并提取各菌株的DNA和RNA,采用PCR分析菌株耐药性改变后的碳青霉烯酶基因IMI、KPC、GES-1、IMP、VIM、NDM-1、OXA23、OXA24、OXA51、OXA58的表达情况;通过实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)分析不同耐药程度的鲍曼不动杆菌耐药基因,包括OXA51,外排泵基因adeB、adeG、adeJ,孔蛋白基因carO、omp33-36、oprC,青霉素结合蛋白基因ponA的表达水平变化;通过全基因组测序及生物信息学工具分析耐药性改变后菌株的差异基因富集情况的变化。结果获得了鲍曼不动杆菌ATCC19606与AB.2014对美罗培南不同耐药程度的11个衍生株,最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为1~128μg/mL。ATCC19606及其衍生株的生长速度和峰值随着耐药性的增加而降低,但AB.2014及其衍生株并没有表现出这种趋势。ATCC19606及其衍生株表达3个碳青霉烯酶基因OXA51、VIM和IMP,AB.2014及其多数衍生株表达4个碳青霉烯酶基因OXA23、OXA51、VIM和IMP,仅AB.2014的一个复敏衍生株出现了OXA23丢失。RT-qPCR结果显示,仅在ATCC19606及其耐药衍生株中oprC基因的表达量随着耐药性的升高而降低,多数耐药基因的表达水平与菌株的耐药水平变化一致。生物信息学分析提示ATCC19606不同衍生株之间的差异基因主要富集于铁载体摄取跨膜转运体活性、细胞外膜、细菌分泌系统和群体感应等,而AB.2014不同衍生株之间的差异基因主要富集于细胞外膜、细胞对化学刺激的反应、阿特拉津降解和RNA聚合酶等。结论碳青霉烯类药物环境压力会引起鲍曼不动杆菌耐药性发生变化,碳青霉烯酶、外排泵、孔蛋白、青霉素结合蛋白多种基因可能同时参与了菌株耐药性的变化;碳青霉烯酶OXA23丢失可能导致耐药鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物复敏。

粉防己碱与多西环素联用对耐药沙门氏菌的抗菌增敏作用及机制研究

旨在探讨粉防己碱与多西环素联合应用对沙门氏菌的体外协同抗菌及其作用机制,为临床联合用药控制耐药性沙门氏菌感染提供理论依据。采用微量肉汤稀释法分别测定粉防己碱与多西环素对沙门氏菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitoty concentration,MIC),棋盘法测定联合用药后的部分抑菌浓度指数(FICI),时间-杀菌曲线验证联合用药的抑菌效果,应用荧光染料溴化乙锭(EtBr)作为外排泵的作用底物,示踪联合用药后沙门氏菌外排泵的活性。结果表明,粉防己碱与多西环素对沙门氏菌的MIC分别为4μg/mL~64μg/mL、320μg/mL~640μg/mL,两药联用的平均FICI为0.46,协同作用占84.62%,相加作用占15.38%;时间-杀菌曲线也证明两药联用具有良好的协同或相加作用;EtBr蓄积试验表明,粉防己碱与多西环素联合组的荧光强度极显著高于多西环素单药组和空白对照组(P<0.01),表明粉防己碱可显著抑制外排泵的活性。粉防己碱与多西环素联用呈协同或相加作用,粉防己碱可明显增强多西环素对沙门氏菌的抗菌活性,其作用机制之一是通过抑制外排泵活性,增强细菌对多西环素的敏感性。

化脓隐秘杆菌CmlA和FloR外排泵抑制剂的筛选

为了筛选出效果较好的外排泵抑制剂,对化脓隐秘杆菌进行了耐药基因检测、药敏试验、联合药敏试验和尼罗红外排试验。结果显示,cfr、cmlA、floR、fexA、catI、catB基因的检出率分别为9.8%、39.22%、41.18%、11.76%、13.73%和31.37%,未检出optrA、poxtA、fexB、pexA基因;槲皮素、木犀草素、黄芩苷、川陈皮素、芹菜素等5种黄酮类化合物对化脓隐秘杆菌均具有良好的抗菌效果;其中木犀草素与3种酰胺醇类药物联用后均有相加作用,FICI=1;5种黄酮类化合物均可以抑制CmlA和FloR外排蛋白对尼罗红的外排,其中木犀草素的外排抑制能力最强。耐药消除试验发现,木犀草素可以不同程度的消减化脓隐秘杆菌对酰胺醇类药物的耐药性。结果表明,木犀草素可通过抑制CmlA和FloR的外排作用,逆转化脓隐秘杆菌对酰胺醇类药物的耐药性,为木犀草素作为天然外排泵抑制剂的临床开发利用奠定了基础。

某院金黄色葡萄球菌耐药性分析及毒素基因与耐药基因检测

目的 了解山西省汾阳医院金黄色葡萄球菌的临床分布、耐药性及毒素基因携带情况,为有效防治该菌感染提供思路。方法 从山西省汾阳医院收集20株金黄色葡萄球菌,采用试纸条法测定菌株对15种抗菌药物的耐药性,采用PCR技术扩增菌株的8种外排泵基因、16种耐药基因和23种毒素基因。结果 金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药率最高(100%),其次是红霉素和克林霉素(70%)。所有菌株对米诺环素、呋喃妥因、阿米卡星、万古霉素及利奈唑胺敏感,多重耐药菌占70%。共检出6个外排泵基因、9个耐药基因和18个毒素基因。外排泵基因谱norA-norB-norC-sepA-mepA-mdeA,耐药基因谱ermC-gyrA-grlA-tet(k),毒素基因谱nuc-see-selp和nuc-pvl-sell-selp占比最高。结论 该院金黄色葡萄球菌耐药性强,外排泵基因、耐药基因和毒素基因分布广泛,临床治疗应优先考虑米诺环素、呋喃妥因和阿米卡星等敏感药物。

革兰氏阴性菌多药外排泵MacAB-TolC的功能与结构

病原菌日益增长的多药耐药性已成为人类健康和生命的主要威胁之一。多药外排泵介导的药物主动外排是细菌产生耐药性的主要原因之一,给感染性疾病的防治带来了极大挑战。深入研究多药外排泵,了解其作用机制,揭示药物结合位点,可以为临床抗感染治疗提供新思路。在革兰氏阴性菌中,一些多药外排泵形成跨越细菌胞外被膜的三联复合物。MacAB-TolC是普遍存在于革兰氏阴性菌中的ABC家族三联外排泵,在近些年逐渐被关注。本文综述了关于MacAB-TolC外排泵的功能与结构研究以及相应抑制剂研发方面的进展。MacAB-TolC外排泵的底物种类多样,包含抗生素、毒力因子以及代谢产物。本文据此将MacAB-TolC外排泵的功能归纳为3类:耐药功能、病理功能和生理功能,并对相应功能分别进行了阐述。在结构研究方面,本文总结了MacAB-TolC外排泵单个组分的晶体结构和组装完全的MacAB-TolC三联外排泵的冷冻电镜单颗粒结构,并对结构数据所揭示的MacAB-TolC外排泵发挥功能的机制进行了论述。最后,本文介绍了MacAB-TolC外排泵抑制剂的最新研究进展,指出解析MacAB-TolC的原位结构,以及MacB结合底物/抑制剂的晶体结构是未来的研究方向,可为外排泵抑制剂的设计和研发提供准确的靶点。

临床烟曲霉菌株的生物特性及唑类耐药机制

目的 探究临床分离丝状真菌(命名AF70)的菌株生物学地位、生物学特性及其耐唑类药物的分子机制。方法 通过形态学和分子生物学技术明确AF70菌株的生物学地位。采用稀释点板法、甲基四氮盐(XTT)还原法、高效液相色谱法和大蜡螟幼虫存活试验探究AF70菌株的产孢能力、生物膜形成能力、麦角甾醇含量和毒力。通过微量液基稀释法和E-test法测定AF70菌株对三唑类,棘白菌素和两性霉素B的敏感性。Sanger测序法明确唑类药物靶基因cyp51A的突变类型,并通过Discovery Studio软件对CYP51A蛋白的三维结构进行分析。荧光定量PCR技术检测麦角甾醇合成和药物外排泵相关基因mRNA表达水平。结果 形态学和分子生物学鉴定AF70菌株为烟曲霉菌株。与标准菌株AF293相比,AF70菌株生物膜形成和产孢能力增加(P<0.05),但麦角甾醇含量差异无统计学意义(P>0.05)。药敏分析结果表明AF70菌株对伏立康唑和艾沙康唑耐药,对伊曲康唑、泊沙康唑、两性霉素B、卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净敏感。AF70菌株的cyp51A基因突变类型为TR46/Y121F/T289A,并存在CYP51A蛋白的支链空间结构改变。同时,AF70菌株cyp51A和外排泵相关基因显著上调表达。结论 烟曲霉AF70菌株是由cyp51A基因突变、过表达以及外排泵基因过表达共同介导对VRC耐药。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特征及其耐药机制的研究

目的分析临床分离耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药特征及其对亚胺培南耐药机制。方法应用BD Phoenix100全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和药物敏感试验,头孢哌酮/舒巴坦采用K-B法;应用聚合酶链反应（PCR）方法检测碳青酶烯酶相关基因（IMP、VIM、GIM、SPM、OXA、GES）、膜微孔蛋白基因oprD2,采用Etest试验观察氰氯苯腙（CCCP）对亚胺培南最低抑菌浓度（MIC）的影响,以研究细胞内主动外排机制。结果耐亚胺培南铜绿假单胞菌除对阿米卡星100%敏感外,对哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦敏感率为48.0%~54.0%,对三代、四代头孢菌素、氨曲南、喹诺酮类等抗菌药物抗菌活性差,敏感率为3.0%~29.0%;对美罗培南29.0%敏感,对氨苄西林/舒巴坦、氯霉素、四环素、复方新诺明全部耐药;检测到IMP阳性率17.6%,oprD2阳性率2.9%,其余耐药基因未检测到;当CCCP存在时,亚胺培南的MIC值下降4个浓度梯度,提示存在主动外排机制的菌株占11.8%。结论耐亚胺培南铜绿假单胞菌除阿米卡星外,对其他常用抗菌药物耐药严重;产IMP型金属β-内酰胺酶、细胞内主动外排机制以及膜微孔蛋白基因oprD2缺失,是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的原因,但膜微孔蛋白基因oprD2缺失,不是铜绿假单胞对亚胺培南耐药的主要机制。