鸡减蛋综合征病毒(EDSV-76)末端前体蛋白的基因结构分析

从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒弱毒株ＡＡ－２，经常规方法提取其病毒核酸后，组建了完整的限制性内切酶ＰｓｔⅠ及ＨｉｎｄⅢ水解片段的基因文库，并对其中ＨｉｎｄⅢ（２１．０ｍ．ｕ．）－ＳａｃⅠ（３３．２ｕ．）进行了序列测定。同源比较分析证明：其Ｌ链含编码病毒末端前体蛋白，容量为５８０个氨基酸残基（ａａ）的开放读码框架（Ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）。由此推导的多肽氨基酸序列及结构特点，如保守序列、核定位信号（Ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ）。等与其他腺病毒的相应多肽存在较大差异。本文为阐明腺病毒末端前体蛋白参与ＤＮＡ复制起始的机制提供了新的依据。

产蛋下降综合征（EDS－76）病毒DNA探针的制备及应用研究

用纯化的产蛋下降综合征（ＥＤＳ－７６）病毒（Ｈ９１毒株）悬液提取的核酸，经琼脂糖凝胶电泳只出现１条分子量较大、背景清晰的核酸带。用ＢａｍＨＩ酶消化产生４个片段，大小分别为１７ｋｂ、１０ｋｂ、４．０ｋｂ和２．０ｋｂ。将其中的２．０ｋｂ片段克隆进ｐＵＣ１８ＤＮＡ载体中，重组质粒ＤＮＡ用ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记作为ＤＮＡ探针，在ｄｏｔｂｌｏｔ中该探针不与鹅胚尿囊液核酸抽提物、马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＤＮＡ、鸡传染性贫血病毒（ＣＡＶ）ＤＮＡ、ＳＰＦ鸡基因组ＤＮＡ等核酸反应，只与３株ＥＤＳ病毒（ＥＤＳ标准毒株ＡＶ－１２７、ＥＤＳＨ９１毒株和从健康鹅体中分离的ＥＤＳＹ８１毒株）ＤＮＡ呈阳性反应。人工感染产蛋母鸡和雏鸡后２４ｈ即可用该探针从泄殖腔棉拭子样品中检测出ＥＤＳ病毒ＤＮＡ，在感染后３５ｈ仍能从部分感染鸡样品中检出。对部分探针检测阳性鸡的泄殖腔棉拭子样品用ＳＰＦ鸡胚分离病毒，并用ＨＡ和ＨＩ试验检测分离病毒的特异性；在感染过程中，同时检测了血清中ＨＩ抗体的消长情况。结果表明，人工感染鸡排毒至少可以维持２个月左右，而且血清中ＨＩ抗体即使很高，也不能阻止感染鸡的排毒。

鸡减蛋综合征病毒(EDSV)主要蛋白的结构分析

鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）中国株ＡＡ－２基因组全长为３２８３８ｂｐ，其编码病毒主要结构蛋白（５２／５５Ｋ、Ⅲａ、五邻体、ｐＶⅡ、ｐＶⅠ、六邻体、１００ｋ、ｐＶⅢ以及纤维蛋白等）的基因依次排列在基因组的中部，Ｅ２区编码ＤＮＡ结合蛋白、ＤＮＡ多聚酶、末端前体蛋白及ＩＶａⅡ的基因也分别排列在ＥＤＳＶ基因组的负链上。对这些蛋白的氨基酸序列进行同源性比较后发现，ＥＤＳＶ的主要蛋白与羊腺病毒（ＯＡＶ）同类物存在不同寻常的高同源性。

鸡产蛋下降综合征(EDS-76)病毒DNA探针制备

鸡产蛋下降综合征（EDS－76）病毒由鸭胚培养增殖，60％饱和度的（NH4）2SO4沉淀，经差速离心和蔗糖垫超速离心提纯病毒。蛋白酶K和SDS消化后，苯酚抽提、乙醇沉淀分离EDS－76病毒DNA。用HindⅢ、BamHI、PstI、EcoRI进行病毒DNA酶切图谱分析。EDS－76病毒DNA经PstI限制酸酶切与pUC19质粒载体连接，转化了JPA101大肠杆菌细胞，筛选带有插入片段的白色菌落，并将筛选的克隆进杆快速酶切鉴定;用光敏生物素标记制成探针。结果表明：所选克隆只与EDS-76病毒DNA杂交，克隆片段的为3kb，标记探针能检出10pg的EDS－76病毒DNA。

产蛋下降综合征（EDS－76）病毒DNA酶切图谱分析

选用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔⅠ、ＰｖｕⅡ、ＨｉｎｄⅢ、ＢｇｌⅠ和ＢｇｌⅡ６种限制性内切酶，对国内４株ＥＤＳ－７６病毒鸡源分离株和国外标准株ＡＶ－１２７及１株鹅源腺病毒的ＤＮＡ进行酶切图谱的比较，结果发现４种鸡源分离株与ＡＶ－１２７株用上述６种酶切的片段数分别为４、８、１０、１０、６和７条。各酶切图形、片段大小亦十分相似，表明均为ＥＤＳ－７６病毒。ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔＩ－ＥｃｏＲＩ的双酶切也得到同样结果。鹅源分离株的酶切片段数分别为６、７、９、７、４和１０条，酶切图形和片段大小均与ＡＶ－１２７有很大不同，表明该分离株可能为１株血清型相同而基因组不同的ＥＤＳ－７６鹅腺病毒。

用 Digoxigenin 标记核酸探针检测 EDS-76 病毒核酸的研究

用ＥＤＳ７６病毒标准ＡＶ１２７株和分离株（Ｂ９６株）感染鸭胚，提取病毒核酸，分别经ＥｃｏＲｌ和Ｐｓｔｌ双酶切，获得图形和大小相似的酶切片段。分别进行ＥｃｏＲｌ和Ｐｓｔｌ单酶切，也得到相似结果。病毒ＤＮＡ经ＥｃｏＲｌ和Ｐｓｔｌ双酶切后，与ＰＵＣ１９质粒载体重组，并转化到ＥｃｏｌｉＪＭ１０１中，筛选出一个插入片段（Ｇ片段）约为２７ｋｂ的重组质粒。用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｍｉｎ标记ＥＤＳ７６ＤＮＡＧ片段（ＥｃｏＲｌ和Ｐｓｔｌ双酶切片段）及含该片段的重组质粒分别制备探针，对ＥＤＳ７６病毒ＤＮＡ进行斑点杂交，两种探针均为阳性，而对照组ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ、ＩＢＤＶ正常鸭胚尿囊液的核酸为阴性。且后一种探针的敏感性高于前者，它的ＤＮＡ检出限量为４ｐｇ水平。结果表明，两种探针具有高度的特异性、敏感性。

ND-EDS-76异源二联油苗的研制

将鸭源鸡新城疫 (ND)病毒 D1 0 株和鸡减蛋综合症 (EDS- 76 )病毒 GC2 株同时接种于同一鸭胚内复制 ,增殖 96 h收取尿囊液 ,用甲醛灭活后加白油佐剂制成 ND- EDS- 76异源二联油乳剂灭活疫苗。该疫苗生产工艺简单 ,成本低 ,经试用表明可有效地预防 ND和 EDS- 76的发生。

减蛋综合征病毒(EDSV)的分离与鉴定

从河北邯郸某鸡场190d未经EDS疫苗免疫的、突然产蛋下降并出现大量软壳蛋、无壳蛋的鸡群中分离到一株病毒,经理化特性鉴定、单抗Dot-ELISA检测、DNA探针斑点杂交,确定分离到的病毒为EDSV。经限制性核酸内切酶酶切分析,表明分离株与EDSV标准株AV127属于同一个基因型。

鸭源和鸡源减蛋综合征(EDS)病毒血凝性的研究

利用减蛋综合征(EDS)病毒凝集红细胞的特性,进行了EDS病毒血凝谱的研究。结果EDS病毒能凝集鸡红细胞,但不凝集鹌鹑红细胞。试验筛选出EDS病毒凝集红细胞的最佳条件。它凝集鸡、鸭红细胞的滴度不受温度(4～37 C)和pH值(5.8～8.0)的影响。鸡源(NE_4株)和鸭源(JE_1 株)的EDS病毒都能凝集鸡、鸭、鹅的红细胞。经氯仿、偏重亚硫酸钾、过碘酸钾处理后,NE_4株的血凝滴度比JE_1株高。解脱试验表明NE_4株凝集红细胞的能力比JE_1 株强,尤其在pH9.2的条件下,两者差异显著。

EDSV HN03株纤维蛋白基因的克隆与序列分析

【目的】研究减蛋综合征病毒(EDSV)河南HN03株纤维蛋白基因全序列,为进一步分析EDSV纤维蛋白基因的结构、功能以及EDSV基因工程疫苗的研究奠定基础。【方法】根据GenBank中收录的EDSV纤维蛋白基因序列(Z86065),设计并合成了1对引物,PCR扩增EDSV河南HN03株纤维蛋白基因。将扩增产物克隆入pTG19-T载体并测序。【结果】测序结果表明,HN03株纤维蛋白基因为1935 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码644个氨基酸,推导的氨基酸序列有5个潜在的N-糖基化位点,有5个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列分析表明,EDSV HN03株与EDSV国际标准株AV-127纤维蛋白基因核苷酸同源性为99.3%,氨基酸同源性为99.2%;与鹌鹑腺病毒QU株纤维蛋白基因核苷酸同源性为98.9%,氨基酸同源性为98.4%。【结论】腺病毒纤维蛋白基因相当保守。

EDSV分离株NE_4、GC_2 DNA的限制性酶切分析

用限制性内切酶BalⅠ、BalⅡ、BamHⅠ、CtaⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、HpaⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、PvuⅠ、SalⅠ、SmalⅠ、XbaⅠ及EcoR28Ⅰ＋BamHⅠ双酶消化对EDSV分离株NE4、GC2r的DNA进行了酶切分析。结果表明，二个分离株与标准株AV127DNA各酶切片段数及各片段的分子量（kb）未见差异，说明二者与AV127株属于同一基因型。

含PHYA基因的EDSV转移载体构建及表达研究

将原核表达载体pET 30中的黑曲霉源植酸酶基因(phyA)亚克隆到真核表达载体pCDNA 3的kpnI-EcoRI位 点。根据pCDNA 3的序列在增强子的上游(209位)和BGH polyA下游(2 049位)设计1对引物HM 1,HM 2扩增出 含phyA基因的表达盒。将此表达盒以平末端连接的方式克隆到减蛋综合征病毒(EDSV)基因组右末端的转移载体 pUHBC的SalI位点,酶切分析鉴定表达盒的方向,得到反向插入重组质粒pEDS-phyA。用Lipofectamine 2000将8 μg pEDS-phyA转染90％满度的鸭胚成纤维细胞,6 h后换生长液,24 h后收获细胞,以pUHBC转染作对照。钼酸胺 法测定试验样品植酸酶酶活为977 U／mL。实验结果表达我们已成功地构建了含植酸酶基因的转移载体,为进一步构 建重组减蛋综合征病毒载体表达植酸酶打下基础。

十五种免疫增效剂对EDS免疫效果影响的对比研究

为了对比研究15种免疫增效剂[猫干扰素、犬α干扰素、犬γ干扰素、猪转移因子、鸡转移因子、牛转移因子、灵芝浸泡液、灵芝孢子粉、灵芝浸泡液+灵芝孢子粉、康健灵(多糖)、康健灵+灵芝孢子粉、黄芪多糖、枸杞、脂多糖、四合一干扰素]对鸡减蛋综合征(egg drop syndrome, EDS)免疫效果的影响,试验将160只健康雏鸡随机分成16组,每只鸡颈部皮下注射ND-EDS-IB灭活油乳剂三联苗,每组试验鸡分别给予不同的免疫增效剂(对照组给予等量的生理盐水);在免疫后第0,7,9,11,13,15,17,19,21,24,29,35,38天采血,通过血凝抑制试验(HI)测定其抗体效价,统计并分析数据。结果表明:鸡转移因子、康健灵(多糖)、灵芝浸泡液和四合一干扰素组的免疫效果最佳,犬γ干扰素、灵芝浸泡液+灵芝孢子粉、康健灵+灵芝孢子粉和黄芪多糖组次之。鸡转移因子组与对照组比最先出现显著性差异(P<0.05,高出2 lb以上),且持续时间最长;康健灵(多糖)、灵芝浸泡液和四合一干扰素组的抗体效价分别高达11.00,10.67,10.50 lb。说明鸡转移因子、康健灵(多糖)、灵芝浸泡液、四合一干扰素、犬γ干扰素、灵芝浸泡液+灵芝孢子粉、康健灵+灵芝孢子粉和黄芪多糖均可在临床酌情应用。结合免疫增效的效果、市场价格、购买与使用的方便程度等方面综合考虑,家禽养殖业可优先考虑鸡转移因子,某些珍禽也可考虑康健灵(多糖)、灵芝浸泡液或者四合一干扰素。

The complete genomic sequence of egg drop syndrome virus strain AAV-2

In the search for the genome of egg drop syndrome virus (EDSV-76) Chinese strain AAV-2, part of restriction endonuclease physical map is analyzed, the complete genomic library is organized. On basis of this, the complete genome nucleotide sequences (32 838 bp in length, including terminal structures) are determined. The data analysis shows: compared with the other Adenovirases, strain AAV-2 has more disparity on genomic structure and the distribution of open reading frame (ORF). There are no clear El, E3 and E4 regions in AAV-2 genome. Two segments located at both ends of genome (l .1 kb and 8.3 kb in length respectively) have no homology with the other adenovirus genomes. In addition, strain AAV-2 genome lacks ORFs encoding El A, pV and pIX, which are common ORFs encoding early, lately proteins in Adenovirus. This reveals differences between EDSA-76, the sole standard strain of group Ⅲ Avian Adenovirases, and the other Avian Adenovirases for the first time. It will help the search for Avian Adenovirus and will also help the search of all Adenovirases.

产蛋下降综合症病毒(EDS’76)核酸序列分析及基因扩增研究

从被EDS＇76病毒感染的鸭胚尿囊液中提取病毒核酸,经Pstl酶切后重组到PT_7/T_3a—19的PstI位点,再转化到Ecoli DH 5a中。在LB平板上筛选了一个EDS特异的PTEZ·P28重组质粒。用双脱氧末端终止法测定了该重组质粒中插入片段的一段核酸序列,在此基础上设计了一对引物,用这对引物成功地从EDS＇76—DNA上扩增出了一个209 bP的核酸片段。

鸡减蛋综合症病毒(EDS-76)的分离与鉴定

采取新疆五家渠某鸡场发病鸡病料，接种鸭胚，分离病毒，病料在鸭胚中盲传至第５代，鸭胚尿囊液ＨＡ效价达２１７，ＨＡ可被ＥＤＳ－７６标准阳性血清抑制。免疫电镜观察到了病毒颗粒。

减蛋综合征病毒(EDS76)的分离和鉴定

鸡减蛋综合征是由腺病毒引起的鸡的主要传染病之一,自1976年国外首次发现该病以来,已在包括我国在内的许多国家流行,给养禽业造成巨大的经济损失。2005年黑龙江省绥化市一个体养鸡场的190日龄商品蛋鸡突然出现产蛋下降,从发病鸡的输卵管中分离到一株具有血凝性的病毒。经过HI试验、AGP试验、理化特性和PCR序列扩增及测序,证明分离到的病毒是一株EDS76V。

减蛋综合征病毒抗体胶体金免疫层析试纸条的研制及初步应用

为建立快速检测减蛋综合征病毒(EDSV)抗体的方法,基于EDSV的Fiber蛋白,制备快速检测EDSV抗体的免疫层析试纸条,为养禽业提供针对病原微生物的感染预警及免疫评估。利用胶体金标记EDSV Fiber蛋白抗原为探针,将羊抗鸡IgG和抗Fiber蛋白的抗体包被到硝酸纤维膜上,分别作为质控线和检测线,对家禽EDSV抗体水平进行监测。结果表明,制备的EDSV免疫层析试纸条具有高度特异性,与其他家禽病毒抗体无交叉反应,仅与EDSV抗体反应,在试纸条上产生可见的检测线;并且制备的试纸条具有高度稳定性,在室温条件下可至少保存6个月。应用制备的检测EDSV抗体的免疫层析试纸条对从河南、安徽、山东等地养鸡场采集的576份鸡血清样本检测,与血凝抑制试验(HI)结果进行平行比较,二者的Kappa值为0.878,具有良好一致性。综上,制备的检测ESDV抗体的免疫层析试纸条具有高度的特异性、敏感性、稳定性和易操作性,对EDSV抗体的临床检测具有实际应用价值。

鸡减蛋综合征病毒中和性单克隆抗体的制备、鉴定及在双抗体夹心ELISA中的应用

为了制备针对鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的中和性单克隆抗体,首先纯化得到重组EDSV纤维蛋白,经血凝试验(HA)鉴定纤维蛋白的血凝活性,HA效价为1∶2~7。之后将纤维蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,小鼠血清的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)效价最高达到1∶409 600,间接免疫荧光试验(IFA)效价最高达到1∶12 800。取效价最高免疫小鼠脾细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞,结合iELISA和IFA检测,经过多轮亚克隆,最终成功获得了2株稳定分泌中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G12和10E11。iELISA结果显示,单克隆抗体9G12和10E11的腹水效价分别为1∶128 000和1∶1 020 000;IFA效价分别为1∶2 000和1∶8 000。Western blot检测结果显示,单克隆抗体9G12和10E11均不能识别变性的EDSV纤维蛋白,表明二者识别纤维蛋白的构象型表位。病毒中和试验结果表明,单克隆抗体9G12和10E11均具有中和活性,中和效价分别为1∶2~7和1∶2~4。亚型鉴定表明,这2种单克隆抗体的轻链均为Kappa型,重链均为IgG1亚型。将基于单克隆抗体9G12和10E11建立的双抗体夹心ELISA方法应用于临床检测EDSV抗原,与荧光定量PCR检测结果的符合率为91.7%。综上,成功筛选出9G12和10E11杂交瘤细胞株,二者分泌抗EDSV特异性抗体,且这2种抗体具有中和EDSV感染活性,可应用于EDSV的临床检测。

减蛋综合征病毒pVⅢ基因和E3区序列测定及结构分析

克隆了减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）中国分离株基因组ＨｉｎｄⅢ－Ｅ片段，并分析了其核苷酸序列。该片段位于基因组中央５８．７～６８．９物理图谱单位（ｍｕ），片段全长共３１９４ｂｐ。其中含有１个完整的和２个不完整的开放性读码框架（ＯＲＦ），分别编码ｐＶⅢ蛋白、１００Ｋ蛋白基因Ｃ端和纤维蛋白Ｎ末端部分。ｐＶⅢ蛋白基因由７５３个碱基（ｎｔ）组成，编码２５０个氨基酸（ａａ），编码产物的分子量为２８５００。氨基酸水平的同源性比较表明，ＥＤＳＶ的ｐＶⅢ蛋白与禽腺病毒１型（ＦＡＶ１）及人和其他动物腺病毒ｐＶⅢ蛋白的同源性为２８％～３６％，而与羊腺病毒（ＯＡＶ）的同源性高达５２％，提示ＥＤＳＶ与ＯＡＶ间的亲缘关系更近。按照人腺病毒基因组结构的特征，在ｐＶⅢ和纤维蛋白基因之间，应为Ｅ３区，但该序列只有２４５个ｎｔ组成，序列中保留了ＴＡＴＡＢｏｘ和ｐｏｌｙＡ信号。但除了２个仅编码４９ａａ和３２ａａ多肽的ＯＲＦｓ外，不编码任何产物，且核苷酸序列与其他腺病毒的Ｅ３区无同源性，证实此区无明显Ｅ３区样结构。