巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)地理株研究Ⅰ.11株巨型艾美耳球虫的分离与基本特征

采用单卵囊分离技术 ,从江苏、安徽、山东、广东、福建和上海等省 (市 ) 10个地区的鸡场及美国的球虫病疫苗中获得了 11株纯种球虫。根据下列特征 :(1)卵囊的大小、形态和颜色 ;(2 )孢子囊的大小和形态 ;(3)形状指数 (卵囊长宽之比 ) ;(4 )虫体肠道中的寄生区 ;(5 )肉眼病变的性质 ;(6 )最早孢子发育时间 ;(7)最短的潜在期 ,对这 11株纯种球虫作了鉴定。结果表明 ,11株纯种球虫均为巨型艾美耳球虫 (Eimeria maxima Tyzzer,192 9)地理株。应用 SPSS软件系统 ,对各株进行描述性统计和方差分析 ,结果显示 ,11株间存在不同程度的差异 。

巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)地理株研究 Ⅱ.11株巨型艾美耳球虫的致病性分析

分别用 0 .1× 10 4、1× 10 4、10× 10 4个 /只孢子化卵囊的剂量感染黄羽肉公雏 ,以临床症状、肉眼病变、平均增重、病变记分和死亡率为判定指标 ,对 11株 E.maxima的致病性进行了分析。结果表明 :各虫株引起的临床症状和各病死鸡的肉眼病变基本相似。各感染组的增重 (0 .1× 10 4组例外 )与对照组相比均有显著差异 (P<0 .0 5 )。在感染 10× 10 4个 /只的剂量时 ,上海株增重最少 ,苏州株和龙岩株增重最多 ;扬州株的病变记分最大 ,苏州株和龙岩株的最小 ,相比有显著差异 (P<0 .0 5 ) ;扬州株、连云港株、福州株、广州株和美国株引起鸡死亡 ,死亡率分别为 2 0 %、10 %、10 %、10 %和10 %。结论 :11个虫株均有致病性 ,扬州株和上海株的致病力较强 。

巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)地理株研究Ⅲ.11株巨型艾美耳球虫的同工酶分析

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳(PAGE)技术,对11株Ei meria maxima和1株E.tenella的孢子化卵囊,进行了乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖磷酸异构酶(GPI)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、葡萄糖磷酸变位酶(PGM)和苹果酸脱氢酶(MDH)的同工酶分析。试验结果显示,E.maxima和E.tenella在LDH、GPI、G6PD、PGM和MDH的酶谱上有明显差异,而在11株E.maxima之间无差异,表明E.maxima的酶变异相当保守。

不同株Eimeria maxima交叉免疫保护性研究

目的比较不同株Eimeria maxima交叉免疫保护性的差异。方法采用单卵囊分离技术从三个不同的地区分离到3株E.maxima:寒亭株(HT)、东阿株(DA)和沂南珠(YN),用其中1株作免疫,然后分别用3株进行攻击,计算各组的相对保护率和相对增重率。结果HT株对DA株、YN株的相对保护率与HT株对HT株的相对保护率差异有显著性(P<0.05),DA株对YN株、HT株的相对保护率与DA株对DA株的相对保护率差异有显著性(P<0.05),YN株对DA株、HT株的相对保护率与YN株对YN株的相对保护率的差异有显著性(P<0.05)。不同组之间和不同株之间对增重影响的差异无显著性(P>0.05)。结论HT株、YN株、DA株之间的交叉免疫保护性存在差异。

巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)地理株研究 Ⅳ.孢子化卵囊蛋白的SDS-PAGE与抗原性分析

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS-PAGE)分析比较了11株巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)孢子化卵囊可溶性蛋白。用上海株、扬州株和美国株的阳性血清,分别对上海株、扬州株和美国株的孢子化卵囊可溶性蛋白进行Western blotting分析,比较这3株球虫孢子化卵囊可溶性蛋白的抗原性。结果显示,11株巨型艾美耳球虫孢子化卵囊可溶性蛋白的SDS-PAGE电泳图谱相似,至少有18条电泳条带,其中有7条相对明显的主带,相对分子质量分别为100 2007、7 000、63 2004、8 3004、1 200、36 300和30 000。Western blotting分析显示,在同源株间与异源株间的印迹图谱未见差异,均有4条免疫印迹条带,相对分子质量分别为103 700、64 200、43 400和37 100。

巨型艾美耳球虫Th1类细胞因子刺激性分子EmARM-β对鸡PBMC和T细胞亚群免疫功能的影响

[目的]本文旨在探讨巨型艾美耳球虫Th1类细胞因子刺激性分子Armadillo/β-catenin样重复序列蛋白(EmARM-β)对鸡免疫细胞功能的影响。[方法]利用密度梯度离心法和免疫磁珠分选法分别分离出鸡外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)、CD8^(+)T细胞和CD4^(+)CD25^(-)T细胞,之后将EmARM-β重组蛋白(rEmARM-β)分别与上述细胞进行体外共孵育6 h,利用CCK-8试剂和qPCR法分别检测并分析其对上述细胞增殖能力及相关细胞因子分泌水平的影响。[结果]经免疫磁珠分选后,流式细胞术检测鸡CD8^(+)T细胞和CD4^(+)CD25^(-)T细胞的纯度分别为93.01%和88.88%。与对照组相比,rEmARM-β显著促进鸡PBMC的增殖能力,显著上调Th1类细胞因子(ifn-γ和il-2)和促炎性细胞因子(il-1β、il-6和il-17a)mRNA水平;显著促进CD8^(+)T细胞的增殖能力,显著上调其ifn-γ、il-2和tnf-α mRNA水平,显著上调穿孔素、fasl(Fas配体)和fas mRNA水平;能显著促进CD4^(+)CD25^(-)T细胞的增殖能力,显著上调其ifn-γ和il-2 mRNA水平,下调il-4和il-10 mRNA水平。[结论]EmARM-β可以有效促进鸡PBMC和T细胞亚群(CD8^(+)T细胞和CD4^(+)CD25^(-)T细胞)的增殖能力,提升其Th1类细胞因子和促炎性细胞因子的分泌水平,提示EmARM-β具有研发鸡球虫病新型疫苗候选抗原的潜力。

巨型艾美耳球虫感染对鸡Toll样受体的影响

为了探究巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)感染对宿主局部免疫组织盲肠扁桃体和系统免疫组织(脾脏和外周血)中Toll样受体(Toll like receptor,TLR)的影响,用巨型艾美耳球虫感染雏鸡,感染后第0、3、7和11天,采集鸡盲肠扁桃体、外周血和脾脏淋巴细胞,用实时荧光定量PCR检测上述组织中8种鸡TLR的mRNA水平变化。结果显示:TLR4和TLR21 mRNA水平在3种组织中无显著变化;TLR2 mRNA水平在感染后第3天开始在外周血和脾脏中显著下降(P<0.05),在盲肠扁桃体中第3和7天无显著变化,在第11天显著上升(P<0.01)。TLR1、TLR3、TLR5、TLR7和TLR15 mRNA水平在3种组织中显著上升(P<0.05),但应答时间有所差异,具体为TLR1和TLR3 mRNA水平在盲肠扁桃体中在第3天开始上升,而在外周血和脾脏中第7天开始上升;TLR5和TLR15 mRNA水平在外周血和脾脏中第3天开始上升,而在盲肠扁桃体中第7天开始上升。结果表明:巨型艾美耳球虫感染上调宿主3种组织中的TLR1、TLR3、TLR5、TLR7和TLR15 mRNA水平,下调外周血和脾脏中的TLR2 mRNA水平;盲肠扁桃体TLR1和TLR3 mRNA水平上升早于外周血和脾脏,而其TLR5和TLR15 mRNA水平上升晚于外周血和脾脏。本研究为揭示鸡TLR在抗球虫感染中的作用提供依据,也为揭示鸡球虫先天性免疫机制提供参考。

巨型艾美耳球虫在4种细胞系中培养的比较

为了选择适宜巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)培养的细胞系,本试验首先用DEAE-52纤维素纯化E.maxima第3代裂殖子,然后将其与不同传代细胞系叙利亚幼地鼠肾(BHK)细胞、鸡胚成纤维(DF-1)细胞、猪肾(PK-15)细胞、非洲绿猴肾(Vero)细胞分别在37℃和41℃培养,每隔15 min进行苏木精-伊红(H.E.)染色比较裂殖子入侵4种细胞所需时长;将裂殖子与4种细胞培养12 h,利用H.E.染色方法比较裂殖子入侵4种细胞的活力;通过比较裂殖子接种时长和接种剂量的试验筛选裂殖子入侵DF-1细胞的最佳培养条件。结果显示,在41℃培养温度下裂殖子入侵所需时长更短;在37℃和41℃培养温度下,裂殖子对DF-1细胞的入侵率均显著高于其他3种细胞(P<0.05),裂殖子在与4种细胞培养期间均发育为裂殖体并释放出裂殖子,但未发育成卵囊;裂殖子接种DF-1细胞6 h后入侵率极显著高于4 h(P<0.01),接种10 h入侵率最高,但与8 h无显著性差异(P>0.05);当细胞数∶裂殖子数为1∶2.5时入侵率极显著增加(P<0.01);在BHK、DF-1、PK-15、Vero四种细胞系中,DF-1细胞为最适宜进行E.maxima体外培养的细胞,在37℃、5%CO_(2)条件下,用2.5倍细胞数的裂殖子接种细胞,共培养6 h可收集细胞进行相关试验检测。目前鸡球虫体外培养细胞系有限,而且细胞培养条件不统一,所以其入侵和发育存在不确定性,而E.maxima在这方面研究更少,因此,本试验可为探索新的鸡球虫细胞培养体系提供参考。

兔肠道球虫病三重PCR方法的建立与应用

为建立一种能同时检测兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫的三重PCR方法,试验首先根据GenBank中的兔穿孔艾美耳球虫Eper基因、黄艾美耳球虫Efla基因、大型艾美耳球虫Eman基因序列设计3对特异性引物,通过优化PCR反应的退火温度和引物浓度,建立一种用于检测兔肠道球虫病的三重PCR方法,然后对该方法的特异性、敏感性及重复性进行评价,最后分别采用该方法及单一PCR方法对82份临床样本进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:所建立的三重PCR方法的最佳退火温度为59.7℃,最佳引物(F/R)浓度为0.15/0.15,0.20/0.20,0.20/0.20μmol/L(Eper、Efla、Eman基因);该方法能特异性扩增出兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫三种兔球虫卵囊靶基因,而斯氏艾美耳球虫、大肠杆菌及沙门氏菌的检测结果为阴性;能够检测出穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫三种兔球虫卵囊基因组DNA的最低限值分别为6.0,6.4,8.0 pg,两种模板浓度组合(60,64,80 ng/μL和6.0,6.4,8.0 ng/μL)批内重复性试验和批间重复性试验所有重复均扩增出预期目的条带;临床样本中,该方法的单一球虫检出率为53.6%,两种球虫检出率为30.5%,三种球虫检出率为7.3%;除黄艾美耳球虫+大型艾美耳球虫的混合感染类型两种方法检测结果的符合率为91.8%外,其他感染类型两种方法检测结果的符合率均为100%,整体符合率为98.8%。说明成功建立了一种可用于检测兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫的多重PCR方法,该方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点。

11株巨型艾美耳球虫的免疫原性分析

用平均增重和病变记分或卵囊减少率等为试验指标,对11株巨型艾美耳球虫的免疫原性进行了分析.结果显示,各虫株每鸡免疫感染100个卵囊后,不仅对攻击1×105个同源株卵囊均产生大于70%的病变记分降低率,而且使每鸡攻击1×104个同源株卵囊时的卵囊产量均减少97.42%以上,在各虫株间无显著差异.各虫株对异源株的交叉免疫力程度不一致,美国株对国内10个虫株的卵囊减少率为20.09%～82.44%,仅3株大于75%,而国内10个虫株对美国株的卵囊减少率为27.43%～95.26%,有5株大于75%;扬州株、南通株、凤阳株、龙岩株、广州株和上海株间的相互卵囊减少率为-1.72%～96.67%,其中南通株对扬州株、凤阳株、龙岩株、广州株和上海株的卵囊减少率均大于75%,上海株对扬州株、南通株、凤阳株与广州株的卵囊减少率为-1.72%～57.69%.

巨型艾美耳球虫纯种鉴定和致病性研究

采用单卵囊感染技术，从鸡球虫混合种中分离出一个纯种球虫，经鉴定为巨型艾美耳球虫（ＥｉｍｅｒｉａＭａｘｉｍａＴｙｚｚｅｒ，１９２９）。该种球虫卵囊为卵圆形，测２４０个的大小范围为２１．２５～３６．２５×１７．５～３０．０μｍ，平均为２８．８１±３．０７×２２．９８±２．７７μｍ，形状指数１．２５。卵囊内有一颗折光性极粒，位于窄端，无外残体。测１２０个孢子囊的大小范围为１５．５～１８．５×７．５～１０．０μｍ，平均为１７．３５±０．６６×８．７４±０．５１μｍ。最短孢子化时间为３０小时，潜伏期１４２小时。用此卵囊对鸡作致病性试验，挑选６０羽１３日龄伊莎（ＩＳＡ）公鸡分为１个不感染组和４个感染组，每羽口服感染１万、５万、１０万或２０万个孢子化卵囊。结果所有感染组与不感染组的平均增重差异达到显著（Ｐ＜０．０５）或极显著（Ｐ＜０．０１）水平，整个试验仅在２０万个的感染组出现１６．７％的死亡率，各感染组的肠道病变记分分别为１．３３、１．８３、２．４２和３．０８。

巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫早熟株对8种抗球虫药的敏感试验

为检测巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫早熟株对常用抗球虫药的敏感性,选用地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星、盐霉素和拉沙洛西等8种抗球虫药进行鸡体试验,通过抗球虫活性百分比(percent of optimum anticoccidial aetivity,POAA)、病变记分减少率(reduction of lesion scores,RLS)、相对卵囊产量(relative oocyst production,ROP)和抗球虫指数(anticoccidial index,ACI)4项指标进行综合评价。结果表明,巨型艾美耳球虫早熟株对8种药物敏感;柔嫩艾美耳球虫早熟株对盐霉素轻度敏感,对地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星和拉沙洛西敏感。本研究结果可为对球虫早熟株疫苗的开发与应用提供实验依据。

利用gateway技术构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA表达文库

[目的]为了寻找可用于研制高效重组疫苗的抗原基因,利用gateway技术构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA表达文库。[方法]首先从新鲜分离的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA并分离纯化mRNA,用Clone MinerTMⅡcDNA文库构建试剂盒构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA初级文库,然后将cDNA从初级文库重组到p VAX1.0上,构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA表达文库,最后用7个已知巨型艾美耳球虫基因的引物鉴定文库。[结果]构建的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA初级文库总容量为0.92×107CFU,插入片段平均大小为1.63 kb;表达文库总容量为2.32×107CFU,插入片段平均大小为1.64 kb。两种文库的阳性重组率均为100%。能用特异性引物从该表达文库扩增出7个已知的巨型艾美耳球虫基因。[结论]该文库质量高,代表性强,为进一步筛选免疫保护性抗原基因奠定了坚实基础。

11株巨型艾美耳球虫繁殖力的比较研究

用巨型艾美耳球虫扬州株、南通株、连云港株、苏州株、凤阳株、青岛株、福州株、龙岩株、广州株、上海株和美国株孢子化卵囊100个/只或10 000个/只,经嗉囔接种7日龄或21日龄无球虫黄羽肉公雏,以麦克马斯特法对感染后第6天至第14天间每天24 h排出的卵囊计数并进行统计分析.结果表明,各虫株的排卵囊量有差异,100个/只卵囊感染7日龄雏鸡时,广州株和凤阳株排卵囊量最多,上海株和苏州株排卵囊量最少;100个/只卵囊感染21日龄雏鸡时,扬州株排卵囊量最多,上海株排卵囊量最少;10 000个/只卵囊感染21日龄雏鸡时,苏州株排卵囊量最多,连云港株和扬州株的排卵囊量最少;排卵囊量随着感染剂量的增加或鸡日龄的增大而增多;在同一感染剂量时,福州株和连云港株增加最多,上海株和苏州株增加最少;在同一感染鸡日龄时,苏州株和上海株增加最多,南通株和扬州株增加最少;各虫株的排卵囊规律极相似,在感染后第7天排卵囊量达峰值,第8天、第9天排出的卵囊量显著减少,第10天排出的卵囊量仅占总量的2%,第14天接近于0%;第6天至第8天排出的卵囊量占总量的87%～99%.

巨型艾美耳球虫早熟株选育及其相关生物学特性研究

为了选育巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)早熟株并观测其生物学特性,运用Jeffers创立的球虫早熟株选育方法,对实验室保存的E.maxima进行了早熟株选育,并比较了所获得的早熟株与母株在卵囊大小、繁殖能力、致病性、免疫保护力等生物学特性上的差异。经过17代早熟株选育,E.maxima的潜在期由母株的142 h缩短至107 h,缩短了35 h。早熟株卵囊的长、宽及大小均比母株小,且差异显著(P<0.05);卵囊形状指数比母株的稍大,但差异不显著(P>0.05)。早熟株的卵囊繁殖能力较母株的低,排卵囊高峰出现在接种后d6,较母株提前1 d。在同等剂量之下,早熟株的致病性低于母株,但免疫保护力和免疫原性与母株相当。早熟株的选育成功,为球虫早熟株弱毒疫苗的研制以及早熟株相关基因的筛选提供了重要材料。

10株巨型艾美球虫rDNA-ITS-1部分序列测定与分析

用一对种特异性引物,对国内10株巨型艾美球虫ITS-1区进行PCR扩增,对扩增产物纯化、测序与分析,并用DNAStar软件对所检测的10株巨型艾美球虫与GenBank中的所有巨型艾美球虫的ITS-1相应序列进行系统发生进化关系分析。结果显示,扬州株、龙岩株和福州株的ITS-1部分序列片段长度为152bp,其余各株均为151bp。10株巨型艾美球虫的同源性为90.7%～100%,在构建的系统发生进化树中分成2大系群,凤阳株形成一个单系群,其余9株为另一系群。虫株间的亲缘关系与地理位置不尽一致,与免疫交叉保护力无相关性。

巨型艾美尔球虫感染对雏鸡肠道乳酸杆菌的影响

取200只红羽肉杂雏鸡,饲喂至8日龄,随机分为3个球虫卵囊剂量感染组(0.5×105、1.0×105和2.0×105个/羽),并设对照组;于感染后1、3、5、7 d,各组分别处死雏鸡5只,测定小肠中段乳酸杆菌的定植数量。结果表明:与对照组比较3个试验组雏鸡肠道的乳酸杆菌定植数量均有降低。其中试验Ⅰ组,在感染后1、3 d,肠道乳酸杆菌定植数对数值分别为(5.46±0.14)和(5.57±0.14),与对照组比差异不显著(P>0.05);感染5、7 d后,分别为(5.71±0.45)和(5.80±0.52),达到差异显著水平(P<0.05)。试验Ⅱ、Ⅲ组,在感染后1 d,达到差异显著水平(P<0.05)。感染后3、5、7 d,肠道乳酸杆菌定植数量对数值与对照组比较达到极显著水平(P<0.01)。试验证明大剂量球虫感染可明显降低雏鸡小肠段乳酸杆菌的定植数量。

巨型艾美球虫重组蛋白Gam82-Y和重组质粒pcDNA-gam82的免疫保护效果研究

为研究巨型艾美球虫NT株重组蛋白Gam82-Y和重组质粒pcDNA-gam82对鸡的免疫保护效果,本研究以平均增重、相对增重率及卵囊减少率等作为评价指标,检测结果显示:中剂量重组蛋白佐剂组(0.5 mg-FCA)和中剂量重组蛋白组(0.5 mg)的免疫保护力均低于卵囊免疫组(p<0.05),但比其他各免疫组高(p<0.05);重组质粒(pcDNA-gam82)免疫组的平均增重、相对增重率、卵囊减少率等方面与重组蛋白免疫组相同,两者均优于未免疫攻虫组(p<0.05),但仍未能够达到卵囊免疫组的免疫保护水平(p<0.05)。

6株巨型艾美耳球虫繁殖力的比较研究

用巨型艾美耳球虫(Eimeriamaxima)上海株、扬州株、南通株等不同地区的6株孢子化卵囊100个·只-1,经嗉囊接种7日龄无球虫黄羽公雏肉鸡,以麦克马斯特氏法计数感染后6～14d每天24h排出的卵囊。结果表明:广州株排卵囊量最多,与凤阳株和龙岩株相近;上海株排卵囊量最少,与扬州株、南通株相近;广州株与上海株、扬州株和南通株均差异显著。各虫株的显露期相似,在感染后第7天排卵囊量达峰值,第6～8天排出的卵囊量占总量的80%～90%,第10天接近0。

巨型艾美耳球虫早熟株免疫剂量研究

为了确定巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)早熟株合适的免疫剂量,本文设立7个早熟株免疫攻虫组、7个母株免疫攻虫组、1个不免疫攻虫组和1个不免疫不攻虫组,7个早熟株/母株免疫组的免疫剂量为孢子化卵囊100、200、400、600、800、1000和2000个/羽,经嗉囊感染,7日龄首次免疫,14日龄以同等剂量进行第二次免疫,21日龄以8×104个/羽的同源母株进行攻虫,28日龄结束试验,以增重、肠道病变记分和卵囊减少率为试验指标。对早熟株中免疫保护效果较好的2个免疫剂量进行重复试验,免疫方法、试验周期、试验指标和攻虫剂量同第一批试验。结果显示:早熟株和母株200、400、600、800、1000、2000个/羽免疫组攻虫后的增重与健康对照组差异不显著(P>0.05),100个/羽免疫组明显低于健康对照组(P<0.05);各免疫组的卵囊减少率均达90%以上,肠道病变记分均与不免疫攻虫组差异不显著(P>0.05)。用早熟株200、400个/羽进行免疫重复试验,两个免疫组攻虫期间的增重和肠道病变记分均与健康对照组差异不显著(P>0.05),而与不免疫攻虫组差异显著(P<0.05),其卵囊减少率均在86%以上。研究结果表明,该巨型艾美耳球虫早熟株保持了良好的免疫原性,每只鸡免疫200或400个孢子化卵囊均可诱发鸡产生良好的免疫保护力,可考虑以200个孢子化卵囊作为该早熟株在疫苗制备中的推荐免疫剂量。