鸡胚接种毒害艾美耳球虫Eimeria necatrix的免疫研究

给15、17、19日胚龄的鸡胚经羊膜腔分别接种不同剂量的毒害艾美耳球虫Eimeria necatrix孢子化卵囊、孢子囊或子孢子,出雏后在无球虫环境中笼养,收集2～7日龄间全部粪便,以饱和盐水漂浮法检查卵囊的产生,并于17日龄时以1.2×105个/鸡的同源孢子化卵囊攻虫,以相对增重率(RWG)、病变计分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)评价免疫保护效果.结果表明,孢子化卵囊、孢子囊或子孢子经羊膜腔免疫接种后对鸡胚的孵化率无明显影响,所有接种组在出雏后2～7日龄间均能检获后代卵囊,攻虫后各免疫组的相对增重率由攻虫对照的38%～42.9%提高到73.2%～90.5%,病变计分减少率达50%～74.9%,相对卵囊产量为攻虫对照组的28.1%～60.2%,表明以一定剂量的E. necatrix孢子化卵囊、孢子囊或子孢子经羊膜腔免疫接种鸡胚,可诱导鸡在出雏后笼养条件下对同源艾美耳球虫的免疫保护力;比较不同剂量、不同胚龄的免疫效果,发现在试验设定条件下于17日胚龄接种8×104个子孢子/胚的效果最好.

鸡球虫重组蛋白rEnApiAP2对鸡免疫保护效果的观察

将毒害艾美耳球虫重组蛋白rEnApiAP2单独免疫(单免)或分别与柔嫩艾美耳球虫重组蛋白rEtGAM56或rEtGAM59联合免疫(联免)雏鸡,同时设rEtGAM56单免、rEtGAM59单免、未免疫攻虫和空白组为对照,分别攻毒害艾美耳球虫或柔嫩艾美耳球虫,以成活率、排出血便数、平均增重、相对增重率、病变记分、卵囊减少率、抗球虫指数(ACI)和血清抗体水平为指标,评价rEnApiAP2单免及与rEtGAM联免的免疫保护效果。结果显示:各试验组的成活率均为100%;与未免疫攻虫组比较,各免疫组鸡排血便堆数减少、平均增重增加。在rEnApiAP2单免组间,低剂量组的相对增重率(82.36%)、卵囊减少率(73.88%)和抗球虫指数(155.26)均为最高,平均病变记分最低(1.71)。攻毒害艾美耳球虫后,联免组的ACI值均大于相应的单免组,其中rEnApiAP2与rEtGAM56联免组的ACI值(169.83)最高。攻柔嫩艾美耳球虫后,rEnApiAP2单免组的ACI值(128.37)低于rEtGAM56、rEtGAM59单免组(130.12、151.88),rEnApiAP2与rEtGAM59联免组的ACI值(141.62)接近于rEtGAM59单免组,rEnApiAP2与rEtGAM56联免组的ACI值(115.46)小于rEtGAM56单免组。各免疫组血清抗体水平均显著高于空白对照组(P<0.05)。rEnApiAP2对毒害艾美耳球虫具有一定的免疫保护效果,与rEtGAM联免可提高对毒害艾美耳球虫的免疫保护力。本研究结果为鸡球虫病重组亚单位疫苗研制奠定了基础。

毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX的原核表达与分析

旨在研究毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX的反应原性及其在虫体内的亚细胞定位。提取毒害艾美耳球虫(扬州株)配子体总RNA,RT-PCR扩增En GPX的ORF编码序列,构建原核表达质粒pET-28a(+)-En GPX,转化至BL21(DE3)进行体外诱导表达,同时制备鼠抗rEnGPX多克隆抗体,对重组蛋白进行Western blot反应原性分析和激光共聚焦免疫荧光定位分析。结果表明,En GPX ORF序列全长753 bp,编码250个氨基酸,体外重组表达蛋白大小约30 ku,主要以包涵体形式存在。该重组蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体,鼠抗rEnGPX多克隆抗体,毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫病鸡康复血清所识别,表明其具有较好的反应原性和交叉反应原性。在天然配子体蛋白中检测出EnGPX,其编码蛋白主要分布于配子体内的Ⅱ型成壁体(WFBII)及卵囊壁上。本研究成功克隆表达了毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX,验证其具有良好的反应原性,并定位于配子体及卵囊壁上。以期为研究En GPX参与卵囊壁形成的分子机制提供新的线索,也为研制新型球虫亚单位疫苗提供新的靶标。

G型产气荚膜梭菌的分离鉴定及其在鸡坏死性肠炎发病模型中的应用

目的:探讨不同诱导因素对鸡坏死性肠炎(Necrotic enteritis,NE)的诱发效果,以便建立鸡坏死性肠炎的发病模型。方法:以安徽省某规模化鸡场采集的病鸡肠道样品中分离出的G型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)(CPG-AH5株)为病原菌,分析单独或联合感染毒害艾美耳球虫对在饲喂高蛋白饲料(添加鱼粉)和不饲喂高蛋白饲料条件下,诱发鸡坏死性肠炎的影响。结果:无诱导因素时,1.1×10^(9)CFU/mL剂量下CPG-AH5株感染可造成肠道损伤(平均病变评分为1.5±0.85分);单一诱导因素(鱼粉或球虫)不能有效促进CPG-AH5株的感染,肠道病变与无诱导因素条件下无显著性提高(2.0±1.15、2.4±1.08,P>0.05);多个诱导因素(鱼粉和球虫)联合诱导可有效促进CPG-AH5株的感染,与无诱导因素和单一诱导因素相比肠道病变显著性提高(3.6±0.52,P<0.001)。结论:鱼粉和球虫联合诱导可显著促进G型产气荚膜梭菌的感染,提高肠道病变。本研究建立了一种鸡坏死性肠炎发病模型,有利于对鸡坏死性肠炎发病机制的研究,为疫苗及药物的后续研发和筛选评价提供了新的技术支撑。

E.necatrix二次感染雏鸡消化道局部体液Igs含量变化

采用间接酶联免疫吸附试验法检测了毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)二次感染雏鸡肠液和胆汁IgA、IgM、IgG含量变化。结果表明,在E.necatrix二次大剂量攻击性感染雏鸡后的初期,三种免疫球蛋白含量呈现一过性下降,随即回升,14d较对照和初次感染雏鸡明显增加,表明球虫初次感染所激发的高水平体液免疫对其二次感染有良好的免疫保护作用。

毒害艾美耳球虫和产气荚膜梭菌双重PCR检测方法的建立

旨在初步建立可同时检测毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的双重PCR及纳米PCR检测方法。基于E.necatrix的ITS-2基因和C.perfringens的α毒素基因分别设计、筛选靶基因位点的特异性扩增引物,通过反应体系和退火温度的优化,建立适用于两种病原的特异性双重PCR和双重纳米PCR检测方法;用所建立的方法对6种其它常见寄生性原虫和3种其他细菌进行PCR扩增以验证其特异性;构建两种病原的重组质粒pMD19-T-ITS2和pMD19-T-cpa,将其按10倍倍比稀释成不同浓度梯度的质粒模板用于所建方法的敏感性试验。结果表明:两种方法均能特异性扩增出E.necatrix约150 bp和C.perfringens约400 bp的目的片段,且所建立的两种检测方法对其他6种其他原虫和3种其他细菌的检测结果均为阴性;双重PCR扩增E.necatrix和C.perfringens的最低模板检出量分别是181和1050 copies,而双重纳米PCR的最低模板检出量分别是1.81和105 copies;临床检测结果显示,所建立的2种方法与临床病原学检测结果一致。成功建立了用于E.necatrix和C.perfringens双重PCR和双重纳米PCR检测方法,且敏感性好、特异性高,可为临床上毒害艾美耳球虫和产气荚膜梭菌感染的检测提供技术支持。

毒害艾美耳球虫山西株的分离和鉴定

为了鉴定造成太谷区某鸡场57日龄蛋鸡死亡的鸡球虫种类,明确其生物学特性,本试验采用饱和食盐水漂浮法和单卵囊分离技术从病死鸡粪便中分离纯化得到1株球虫;将分离球虫口服接种SPF鸡,观察并测定卵囊最短孢子化时间、裂殖体寄生部位和大小、卵囊寄生部位和大小、潜隐期、死亡率、增重情况、肠道病变记分等指标,了解该虫株的生物学特点并初步鉴定其类型,随后采用序列特征性扩增区域(SCAR)标记技术进一步确定虫株类型。结果显示,分离虫株的裂殖体寄生于空肠,平均大小为(63.17±7.66)μm×(47.12±6.91)μm,卵囊仅盲肠可见,平均大小为(19.92±0.20)μm×(19.27±0.11)μm,虫株潜隐期为152 h,最短孢子化时间为18 h,接种5.0×104个卵囊/羽和1.1×105个卵囊/羽的分离虫株可分别造成40%和50%的实验鸡死亡,相对增重率下降至31.61%和20.87%,病变记分分别达到3.9和4.0;SCAR标记扩增显示,分离虫株与毒害艾美耳球虫(E.necatrix)的同源性达97.1%,命名为E.necatrix-CN-SX-2018。结果表明,本试验分离得到1株致病性较强的E.necatrix,不仅丰富了山西省E.necatrix流行毒株的生物信息,也为鸡球虫疫苗评价提供了良好的种子资源。

鸡毒害艾美耳球虫病防控技术研究进展

毒害艾美耳球虫是致病力最强的鸡球虫虫种之一,可引起鸡急性小肠球虫病,每年给全球养鸡业造成重大经济损失。饲料添加抗球虫药及活卵囊疫苗免疫仍为当前防控小肠球虫病的主要手段,然而大量抗球虫药物的长期使用导致临床虫株出现广泛而严重的耐药性,特别缺乏针对毒害艾美耳球虫的特效药物,而现有鸡球虫病活疫苗对于毒害艾美耳球虫的免疫保护效果仍有待提高。近年来,国内外学者针对毒害艾美耳球虫的药物及疫苗做了大量研究工作,论文对近年来关于毒害艾美耳球虫病防控技术的研究进展进行总结归纳,以期为治疗毒害艾美耳球虫病的药物研发及疫苗研制提供参考。

不同剂量和免疫次数对鸡毒害艾美耳球虫免疫保护力的影响

以相对增重率(RBWG)、饲料转化率(FCR)和盲肠相对卵囊产量(ROP)为指标,评价了1次或2次分别以1×103个或3×103个毒害艾美耳球虫(E.necatrix)孢子化卵囊(SO)/鸡剂量免疫接种后特异性免疫力的产生和持续时间。笼养岭南黄肉雏鸡于3日龄1次或3日龄和10日龄2次分别接种不同剂量的E.necatrix SO后,于17日龄(2次免疫组为24日龄)、34日龄和50日龄时以14×104SO/鸡剂量的同源卵囊攻虫,结果表明,免疫后2周卵囊接种鸡已产生坚强免疫力,1次免疫接种者(17日龄)高、低2个不同剂量组的RBWG、FCR和ROP分别为95.5%、2.32、24.54%和101.4%、2.32、21.1%;而2次免疫组(24日龄)的上述指标则分别为106.5%、2.44、9.3%和98.2%、2.38、7.48%。至34日龄和50日龄攻虫时,这些指标均有不同程度的下降,且随着时间延长,下降更为明显,但2次免疫处理组的这些指标均明显优于1次免疫者;同一次处理的不同剂量组间无明显差异。结果揭示,雏鸡口服免疫接种一定剂量的E.necatrix孢子化卵囊后可迅速诱导鸡体特异性免疫力的产生,但免疫保护力在笼养条件下持续时间较短。

鸡球虫病四价活疫苗对毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的免疫效果观察

为评价一种商品化鸡球虫病四价活疫苗[柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫]对E.necatrix和E.tenella的免疫保护效果,本研究基于试验鸡血便记分、存活率、相对增重率、病变值、卵囊值及抗球虫指数(ACI)等指标对其免疫效果进行检测。结果表明,免疫攻虫组抗E.necatrix和E.tenella的ACI分别为157.3和135.6,均低于160,表明该球虫疫苗抗两种球虫的效果均为低效。然而,免疫攻虫组鸡血便数量、血便记分、增重、卵囊产量和病变记分等指标均优于阳性对照组。综合指标显示,该疫苗对E.necatrix和E.tenella具有一定的免疫保护力,但单纯采用疫苗并不能够达到防控鸡球虫病的目的。

EnMIC2重组减毒沙门氏菌的构建及免疫保护效果研究

成功构建了表达鸡毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)广东株(GD)微线蛋白2基因(EnMIC2)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌,在IPTG诱导下获得了EnMIC2的高效表达,SDSPAGE分析表明,表达产物约占菌体总蛋白的8.6%,分子量大小约为35ku,与抗E.necatrix的高免血清进行WesternBlotting,结果为阳性。将重组减毒沙门氏菌以108和109CFU/鸡免疫4日龄岭南黄肉鸡,免疫后2周血清中可检测到特异性IgG,3周时抗体水平达到峰值,同时可在肠道检测到特异性IgA的分泌。免疫接种后3周,试验鸡分别经口攻击感染500个E.necatrix(GD)孢子化卵囊,结果显示免疫组与非免疫组有相似的排卵囊曲线;但108和109CFU免疫组的卵囊总产量分别能降低26.62%和48.92%。

毒害艾美耳球虫晚熟系选育及其生活史研究

以剂量为1200～20000个孢子化卵囊/羽的毒害艾美耳球虫(E.necatrix)北京株(中熟系)感染3日龄京星黄羽肉仔鸡,收集感染后第11天粪便中卵囊,孢子化后接种无球虫鸡进行连续传代,经传代16次后,发现其排卵囊高峰较母株(中熟系)推迟了2天,即由接种后第7天推迟到第9天,且连续3代排卵囊高峰均出现在第9天,有较好的稳定性。生活史研究表明,其各阶段虫体均比母株的大,但潜在期不变,推测可能是选育得到的晚熟系卵囊中尚含有少量中熟系卵囊的缘故。

鸡毒害艾美耳球虫LZ株MIC5基因的重组表达及其表达产物的抗原性分析

根据已发表的鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)微线蛋白5(Microneme protein 5,MIC-5)基因的核苷酸序列设计引物,以毒害艾美耳球虫(E.necatrix)DNA为模板,利用PCR方法扩增出EnMIC-5部分基因片段。将基因片段与pMD18-T simple载体连接,重组质粒测序结果表明EnMIC-5基因大小为1 470 bp,编码490个氨基酸。EnMIC-5与pET-28a(+)载体构建重组表达质粒pET-EnMIC-5,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,表达产物为相对分子质量约57.5 ku的融合蛋白。Western-blot分析结果表明表达蛋白可被鸡感染E.necatrix阳性血清识别。用重组蛋白免疫昆明鼠,一免后15 d即可检测到相应抗体,且抗体在三免后40 d仍维持较高水平,证实重组蛋白具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。

毒害艾美耳球虫晚熟系生物学特性研究

本文对毒害艾美耳球虫晚熟系基本生物学特性进行了研究。结果表明,晚熟系的致病性与同等剂量中熟系的相当;繁殖能力高于中熟系,且每羽鸡的排卵囊总量与剂量成正相关,每个卵囊的繁殖能力与剂量成负相关;在同等剂量免疫下,晚熟系的免疫原性好于中熟系;2次免疫后,晚熟系免疫组的保护力与中熟系的相当,攻虫后卵囊繁殖减少率均在99%以上。

毒害艾美球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建

为构建毒害艾美球虫孢子化卵囊cDNA表达文库，用Trizol试剂提取毒害艾美球虫孢子化卵囊总RNA，采用SMART技术，在逆转录酶的作用下将总RNA反转录成第一链cDNA，经LD-PCR扩增合成双链cDNA（ds cDNA）。经蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切，过CHROMA SPIN-400^TM柱去除小于400bp的片段，与λTriplEx2^TM噬菌体载体连接，用GigapackⅢGold^TM载体蛋白包装，构建了cDNA噬菌体表达文库。经测定，原始文库容量为4．72×10^6pfu／mL，扩增后的文库容量为2．62×10^10pfu／mL，重组率为97．5％，插入片段为500～1100bp。证实，该文库质量良好，为毒害艾美球虫新基因的筛选、克隆及功能研究奠定了基础。

毒害艾美耳球虫致病性与抗药性研究

用毒害艾美耳球虫杨凌株(YLn)感染14日龄雏鸡,检测毒害艾美耳球虫的致病性及其对4种常用抗球虫药的敏感性。以最适抗球虫活性百分率、抗球虫指数、相对卵囊产量和病变记分减少率为指标,进行综合评定,其抗药程度分为无抗药性、轻度抗药性、中度抗药性和完全抗药性4个等级。结果表明,该虫株对雏鸡有很强的致病性,每羽鸡经口接种1×105个孢子化卵囊时,致死率达63.3%;该虫株对地克株利有完全抗药性,对马杜拉霉素有轻度抗药性,对氯羟吡啶和氯苯胍无抗药性。

毒害艾美球虫二次感染雏鸡外周血液免疫功能的变化

将180只14日龄雏鸡随机分为毒害艾美球虫(Eimeria necatrix)初次感染组、二次感染组和对照组,应用免疫SPA菌体花环、间接ELISA及细胞培养技术和四甲基偶氮唑盐(MTT)测定法对相关免疫学指标进行了检测,以研究毒害艾美球虫二次感染对雏鸡外周血液免疫功能变化的影响。结果显示,毒害艾美球虫二次感染雏鸡外周血液T、B淋巴细胞数量及其对ConA或PMA的增殖反应和血清IgG、IgM、IgA免疫球蛋白含量均不同程度地高于未感染毒害艾美球虫的对照组雏鸡。证实毒害艾美球虫二次感染雏鸡外周血液的细胞免疫和体液免疫功能均明显提高。

一毒害艾美耳球虫田间分离株耐药性分析

用鸡体实验法,以相对卵囊产量(ROP)、病变记分减少率(RLS)、最适抗球虫百分数(POAA)和抗球虫指数(ACI)等4项指标,分析了一株毒害艾美耳球虫对复方磺胺氯吡嗪钠(20%磺胺氯吡嗪钠+4%二甲氧苄啶)、血痢宁(磺胺氯吡嗪钠可溶性粉)、贝尔球康(又称鸡球虫散,含青蒿、仙鹤草、何首乌、白头翁、肉桂等)、百球清(妥曲珠利)、马杜球败(马度米星铵预混剂)等5种抗球虫药的耐药性。结果显示:该株毒害艾美耳球虫对百球清无耐药性,对复方磺胺氯吡嗪钠和血痢宁有轻度耐药性,对贝尔球康无耐药性或轻度耐药性,对马杜球败有完全耐药性。提示该养殖场应停止使用马杜拉霉素,改用妥曲珠利或贝尔球康,但必须进行轮换用药或联合用药,以延长药物的使用寿命。

毒害与巨型及毒害与柔嫩艾美耳球虫间在免疫方面的相互影响

本研究以黄羽肉鸡为实验动物,以死亡率、平均肠道病变记分、平均增重、相对增重率、相对卵囊产量、抗体水平等为评价指标,分别研究了毒害艾美耳球虫与巨型艾美耳球虫(两者在裂殖生殖阶寄生部位相同)、毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫(两者在配子生殖阶段寄生部位相同)间在免疫上的相互影响。结果显示:毒害艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫混合免疫的保护效果比毒害艾美耳球虫单独免疫好,虽略低于巨型艾美耳球虫单独免疫,但仍具有免疫保护性;毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫混合免疫的保护效果比毒害艾美耳球虫单独免疫好,与柔嫩艾美耳球虫单独免疫相比无明显差异。结果表明巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫对毒害艾美耳球虫的免疫均具有一定的协同效应;毒害艾美耳球虫对巨型艾美耳球虫的免疫有一定负面影响,而对柔嫩艾美耳球虫的免疫无影响。

毒害艾美耳球虫初次感染对雏鸡外周血液免疫功能的影响

应用免疫SPA菌体花环、间接ELISA及细胞培养技术和四甲基偶氮唑盐(MTT)测定法对毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)初次感染雏鸡外周血液的T、B细胞数量及其对ConA或PMA的增殖功能和IgG、IgM、IgA含量的动态变化进行了较全面系统的研究。结果发现,E.necatrix初次感染雏鸡外周血液的T、B细胞数量及其相应增殖功能、血清中上述三种免疫球蛋白含量均不同程度地高于未感染的对照雏鸡,表明E.necatrix初次感染雏鸡外周血液的细胞免疫和体液免疫功能均明显提高。