柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)早熟株与亲本株致病性和繁殖力的研究

通过对经15代选育的柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)山西株的早熟株与其亲本株的繁殖力和致病性进行比较研究,证实早熟株的潜隐期比亲本株缩短21 h,繁殖力下降40%左右;对致病性的研究显示,早熟株感染后对鸡只增重、AC I的影响较小,对11日龄雏鸡的半数感染量和半数致死量较亲本株增大,肠道病变记分较亲本株下降。由此认为,该早熟株符合球虫早熟株的特性,可用于鸡球虫病早熟苗的制作。

柔嫩艾美耳球虫卵囊cDNA文库的初建

利用Trizol一步法从柔嫩艾美耳球虫孢子化10h卵囊提取总RNA。利用poly(A)QuikmRNAIsolationkit分离纯化了mRNA。采用cDNASynthesisKit合成cDNA,以XR-λZAP为载体,构建了cDNA表达文库,经蓝白斑筛选,其重组率为98%,滴度为0·9×106pfu/mL,扩增后滴度为1×109pfu/mL。随机取10个克隆,提取λDNA后,经PCR鉴定,插入片段长度大于0·4Kb。该cDNA表达文库的构建为下一步功能基因的筛选等奠定了良好基础。

鸡柔嫩艾美尔球虫ZJ株3-1E基因的原核表达及鉴定

本实验对E.tenellaZJ株的3-1E基因进行了克隆和表达。根据已报道的柔嫩艾美尔球虫3-1E基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增得到一条特异片段,将扩增产物克隆至pUCM-T,转化感受态菌DH5α,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列比较,核苷酸同源性为99.5%。然后将重组质粒和表达载体pET-30a分别以EcoRⅠ、SalⅠ酶切后构建重组表达载体pET-30a-3-1E,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Westernblot检测显示,3-1E基因在大肠杆菌中成功表达;融合蛋白的分子量约为27ku,诱导6h的蛋白表达量可达到47.024%。

柔嫩艾美耳球虫山西分离株的分离与致病性观察

运用单卵囊分离技术，从山西省某鸡场鸡球虫感染粪便样品中获得l株纯种球虫，鉴定为柔嫩艾美耳球虫并命名为Eimeria tenella SX010323，并对其致病性进行了研究。（1）该球虫卵囊寄生于盲肠、为宽卵圆形，卵囊壁光滑、褐色，无卵膜孔，有极粒，无内、外残体。孢子囊呈长卵圆形，有斯氏体。卵囊大小范围为（16．80～28．80）μm×（14．40～25．20）μm，平均大小为（21．54±0．24）μm×（17．85±0．24）μm，形状指数为1．21±0．05。子孢子，大小范围为（10．20～12．75）μm×（4．40—7．25）μm，平均大小为（11．54±0．24）μm×（6．27±0．43）μm。潜隐期为141h，最短孢子化时间为19h；（2）63只11日龄的海兰白公雏随机分为7组，分别口服感染此新鲜卵囊1×10^3、5×10^3、1×10^4、2×10^4、5×10^4、1．0×10^5个，并设立不感染对照组。结果表明：所有感染组增重均低于对照组（P〈O．05），各感染组间随着感染剂量的增加，增重和增重率显著降低，血便率和盲肠病变记分增加（P〈0．05）；（3）将4℃分别保存17、13、10、4、1个月和新鲜孢子化的虫株卵囊，以1．5×10^4个／只的剂量感染11日龄雏鸡，每组10只。结果表明：保存1个月和4个月活力较高，保存10个月活力开始下降，保存13、17个月活力下降较大。

不同地理株柔嫩艾美耳球虫卵囊排出量的比较研究

试验采用来自吉林省怀德县、伊通县头道乡和伊通县大虎山等地的柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵囊，以每只鸡5000，1×10^4，1×10^5个的剂量，口服接种7目龄和14日龄无球虫从肉鸡，对感染后6～13d每日24h内所排出的卵囊计数，并对其进行统计分析。结果表明：7目龄雏鸡接种剂量为5000，1×10^4个时伊通大虎山株的排卵囊量最多，接种剂量为1×10^5个时怀德株的排卵囊量最多。14日龄雏鸡接种剂量为5000，1×10^4个时伊通大虎山株的排卵囊量最多，接种剂量为1×10^5个时怀德株的排卵囊量最多。结果还显示无论接种剂量相同与否，各虫株均从接种后第6d开始排卵囊，第7d达到高峰，第8，9d开始减少，至第13d趋于0。

化学致弱柔嫩艾美耳球虫杂交F2株免疫性能研究

采用化学致弱剂致弱柔嫩艾美耳球虫杂交F2株卵囊。将致弱的卵囊分别饲喂3组7日龄AA肉仔鸡进行免疫,免疫剂量分别为4×103,8×103,16×103个/只。首免7日龄,二免14日龄,二免剂量与首免相同。二免后第7 d用吉林野毒株卵囊进行攻虫,剂量为5×104个/只。攻虫后第7 d以存活率、相对增重率、病变值、抗球虫指数(ACI)、卵囊值、粪便计分等指标测定化学致弱剂致弱卵囊后免疫性能。结果表明:采用化学致弱剂致弱杂交F2株卵囊后的免疫效果明显高于非致弱免疫组和对照组,尤其免疫剂量为8×103个/只时致弱杂交F2株卵囊免疫效果最佳。

鸡柔嫩艾美耳球虫HN株3-1E基因的原核表达与鉴定

根据已报道的柔嫩艾美耳球虫3-1E基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增得到1条特异片段,将扩增产物克隆至p MD-18T载体,转化感受态菌JM109,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与已发表的国内外相关虫株的3-1E基因序列比较,核苷酸的同源性均在99.2%-99.8%,氨基酸的同源性均在98.2%-100%。然后将重组质粒和表达载体p GEX-4T-1分别用Xho I和EcoR I酶切后构建重组表达载体p GEX-3-1E,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测显示,3-1E基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白的分子量为44.7 ku,诱导表达5 h的蛋白表达量可达到30%以上。