不同基因型长穗偃麦草幼胚诱导再生体系的构建和比较研究

长穗偃麦草是一种耐盐碱、高产优质的多年生牧草和生态草,在我国盐碱地改良和滨海地区生态环境建设中占有重要地位,但其生物技术体系尚不成熟。本研究以来源不同的8个长穗偃麦草种质为试验材料,利用组织培养技术开展幼胚再生体系构建,筛选适宜构建遗传转化体系的优异受体材料。结果表明,在改良后的诱导培养基(MS培养基+0.5 g/L L-谷氨酸+0.5 g/L L-脯氨酸+0.3 g/L酶水解酪蛋白+30 g/L麦芽糖+2 mg/L 2,4-D+7 g/L琼脂)上,长穗偃麦草种质培养第3 d形成较小的愈伤组织,培养4周后分化。不同基因型长穗偃麦草在相同培养基上的幼胚愈伤组织诱导率、分化率和再生时间差异显著,其中4号材料的幼胚出愈率高达97.92%,分化率为88.33%,生根率为100.00%,再生时间较短,为56.2 d,可作为长穗偃麦草遗传转化的理想底盘材料。

三个小麦野生近缘种抗条锈性传递的初步研究

以当前小麦条锈病菌的优势小种条中２９ 号、３０ 号和３１ 号测定了小麦近缘植物长穗偃麦草、簇毛麦和华山新麦草及其各自与小麦的杂交后代的抗条锈性。试验结果表明，３ 个小麦近缘植物均含有宝贵的抗条锈基因，此类基因具有较强的传递性能，可在小麦遗传背景下高度表达，表现出良好的抗条锈性能。

重金属Cd Zn对长穗偃麦草生理生化特性的影响及其积累能力研究

以长穗偃麦草为材料,采用土培试验方法,研究了重金属Cd、Zn单一及复合污染对长穗偃麦草的生物量、保护酶(SOD和POD)、丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)的影响,及长穗偃麦草对Cd、Zn的积累能力。结果表明,Cd、Zn单一及复合污染下,长穗偃麦草生物量随Cd和Zn浓度的升高而降低,与对照存在显著差异(P<0.05);Cd和Zn单一污染下,随着Cd、Zn浓度的升高,SOD、POD、MDA、Pro含量增加;Cd和Zn复合污染下,随处理质量浓度的增加,SOD呈下降趋势,POD和MDA呈增加趋势。Cd10Zn200处理下Pro含量减少,随Cd和Zn质量浓度的增加,其他复合处理下的Pro含量增加;植株根部的Cd和Zn积累量均大于地上部的积累量。综合实验结果,可初步判断长穗偃麦草能积累和忍受一定量的Cd、Zn,Cd和Zn复合污染对上述各指标的毒害效应大于同水平单元素污染的效应。长穗偃麦草根茎发达,生物量大,在生长过程中可通过生物量带走部分重金属Cd、Zn,因此长穗偃麦草具有修复重金属Cd和Zn污染土壤的潜能。

普通小麦与高冰草体细胞杂种F_5代株系的核型分析

为了研究小麦与高冰草体细胞杂种的细胞遗传学规律 ,对普通小麦济南 177与高冰草的体细胞杂种 F5代的高秆株系 - 1- 9和矮秆株系 - 1- 3的根尖染色体数目进行了镜检观察 ,结果表明 ,两个株系分别有 86 .5 9%和82 .4 5 %的细胞其染色体数目分布在 4 0～ 4 2之间。核型分析发现 , - 1- 9和 - 1- 3与亲本济南 177的差别主要在2 A、5 A和 6 B染色体上 ,而且与亲本相比染色体发生结构变异 ,两个杂种株系之间亦存在明显的染色体形态差异。

抗条锈病小偃麦双体异附加系山农87074-519的鉴定

综合利用抗性接种鉴定、细胞学分析、SSR分子标记和基因组原位杂交(GISH)技术相结合的方法,对从长穗偃麦草与小麦复合杂交后代中选育的抗条锈病种质系山农87074-519进行了鉴定。结果表明,山农87074-519的根尖细胞染色体数目2n=44,花粉母细胞减数分裂中期I(PMCMI)绝大多数细胞内可观察到22个二价体,平均染色体构型2n=44=21.82Ⅱ+0.36Ⅰ,它与普通小麦中国春杂种F1的多数花粉母细胞内染色体构型为2n=21Ⅱ+1Ⅰ,因此它是1个附加了1对长穗偃麦草染色体的双体异附加系;以假鹅冠草St基因组总DNA作探针进行原位杂交发现山农87074-519的44条染色体中有2条出现黄绿色杂交信号,且杂交信号遍布整条染色体,证明其附加的长穗偃麦草染色体为St基组;利用SSR分子标记技术,在170对SSR引物中筛选出特异引物BARC165,它能稳定地在山农87074-519中扩增出长穗偃麦草特异标记BARC165268;将长穗偃麦草中BARC165的特异扩增片段克隆测序后制备成探针进行原位杂交,可在山农87074-519的间期染色体和有丝分裂中期染色体检测到杂交信号。山农87074-519综合农艺性状较好,对条锈病免疫,其抗性基因为显性,且位于附加的长穗偃麦草St基组染色体上,暂将其表示为YrSt。该种质系在小麦的遗传改良中具有重要利用价值。

3份长穗偃麦草种质的体细胞核型分析

采用根尖压片法,对不同国家来源的3份长穗偃麦草(Elytrigia elongata)种质材料的体细胞染色体核型进行分析,旨在为其细胞学特性和系统演化的研究奠定科学基础。结果表明:来源于中国新疆的EE001细胞染色体相对长度组成为1L+17M2+15M1+2S,核型公式为K(2n)=10X=70=50m+16sm+4st;来源于德国的EE014细胞染色体相对长度组成为3L+14M2+13M1+5S,核型公式为K(2n)=10X=70=48m+20sm+2st;来源于葡萄牙的EE020细胞染色体相对长度组成为5L+11M2+15M1+4S,核型公式为K(2n)=10X=70=38m+22sm+8st+2t。3份长穗偃麦草种质的体细胞染色体核型均为"2B"类型。

(普通小麦/长穗偃麦草)F_1小孢子发生和雄配子体发育的细胞学特点

试验用压片法对（普通小麦／长穗偃麦草）Ｆ１小孢子发生和雄配子体发育进行了细胞学观察。结果表明：１．（普通小麦／长穗偃麦草）Ｆ１花粉母细胞减数分裂过程中出现许多异常现象；在ＰＭＣＭＩ出现较高频率的单价体和多价体；但是减数分裂过程能够完成，并且四分孢子的败育率较低。２．在雄配子体发育过程中可观察到具有多微核、体积不等的小孢子，并发现经过对称孢子有丝分裂产生的二胞花粉；在花粉发育的不同时期均可观察到花粉的败育，但在第一次孢子有丝分裂期败育率最高；Ｆ１杂种不能形成足够正常的花粉是其不育的重要因素之一。

4种牧草种间竞争力和种间关系的研究

盆栽条件下利用添加系列设计对箭舌豌豆(ViciasativaCV.333/A),黄花草木樨(Melilotsofficinalis),牛尾草(Festucaelatior)和长穗偃麦草(Elytrigiaelongata)个体的种间关系和种间竞争力进行了测定。结果表明:81.3%的目标种单株生物量潜势Pmax与邻居种密度显著负相关,56.3%的目标种单株生物量潜势Pmax与邻居种生物量呈显著负相关(P<0.05),邻居种密度平均可解释74.9%的目标种生物量变异。4个种的竞争效应和竞争反应对邻居种敏感,它们的等级无显著的协同性(P>0.05)。1年生豆科牧草箭舌豌豆的竞争效应和竞争反应均占首位,生长当年与多年生牧草混播有生长优势;草木樨和长穗偃麦草的竞争反应较大,生长后期生长优势明显。

中间偃麦草和长穗偃麦草解剖结构的扫描电镜观察

运用扫描电镜观察了中间偃麦草Elytrigia intermedia和长穗偃麦草E．elongata的根、茎、叶以及根茎的形态解剖结构，结果显示：2种植物的根形态均由表皮、皮层和中拄组成，表皮着生大量根毛，内皮层细胞壁5面加厚，在横切面上呈马蹄形；茎与根茎的维管束分内外两圈分布，中央有髓腔；叶片形态由表皮、叶肉和叶脉3部分构成，表皮细胞包括长细胞、附属物、气孔器细胞和泡状细胞。中间偃麦草和长穗偃麦草的叶片表皮微形态上存在显著差异．其中长穗偃麦草叶脉上分布3～4列乳突．而中间偃麦草叶脉上则分布3～4列刺毛，另外在根皮层细胞中发现了发达的类似通气组织的结构，产生原因亟待进一步研究。

长穗偃麦草EeSKOR启动子的克隆及功能分析

为了研究外整流钾通道蛋白(stelar K+outward rectifier channels,SKOR)基因SKOR在长穗偃麦草中的功能,利用热不对称交错PCR(Tail-PCR)技术,克隆了长穗偃麦草EeSKOR启动子,并进行启动子顺式作用元件及基因表达分析。结果表明:(1)成功获得长穗偃麦草EeSKOR基因起始密码子上游798 bp启动子序列,命名为pEeSKOR。(2)EeSKOR启动子除必须具备的核心启动元件外,还含有特异转录因子结合位点、植物激素响应元件、光响应元件、组织特异的启动元件和胁迫响应元件。(3)成功构建植物表达载体pEeSKOR∷GUS,经农杆菌介导的瞬时转化,EeSKOR启动子驱动GUS报告基因可在拟南芥的叶、叶柄和根中表达。(4)实时定量PCR检测显示,在NaCl、PEG、ABA和SA处理下长穗偃麦草EeSKOR基因在根中呈现不同的表达模式,NaCl处理下EeSKOR的表达量呈先下调后上调趋势;PEG处理下EeSKOR的表达量呈上调趋势,且随着时间的延长显著上调;ABA处理下EeSKOR的表达受到抑制且随处理时间延长呈显著下调趋势;SA处理下EeSKOR表现出先上调后下调趋势,且在处理72 h时表达量显著低于正常表达水平。研究认为,EeSKOR基因的表达受NaCl、PEG、ABA和SA的诱导调节。该研究结果为进一步系统研究长穗偃麦草EeSKOR基因功能提供重要理论依据。

长穗偃麦草花序分化过程的观察

对长穗偃麦草幼穗的分化和发育进行了观察,结果表明,长穗偃麦草幼穗分化是一个持续过程,可分为8个时期:初生期、伸长期、结节期、小穗突起期、颖片突起期、小花突起期、雌雄蕊形成期和抽穗始期。长穗偃麦草幼穗的分化具有很强的规律性:在整个穗上,中上部的小穗最先发育,然后逐渐向上、向下发育,基部的小穗最后发育;在每一小穗上,基部的小花最先发育,然后由基部向上逐渐发育。

中间偃麦草和长穗偃麦草染色体核型分析

选用从国外引进的中间偃麦草(Elytrigia intermedia)和长穗偃麦草(E.elongata)种子为材料,采用根尖压片法进行细胞染色体核型分析。结果表明,中间偃麦草染色体数目为2n=6x=42,染色体相对长度组成为:10L+10M2+12M1+10S,核型公式为:K(2n)=6x=42=34m+8sm,属于"2B"类型。长穗偃麦草染色体数目为2n=10x=70,染色体相对长度组成为:10L+22M2+30M1+8S,核型公式为:K(2n)=10x=70=38m+22sm+8st+2t,属于"2B"类型。本研究结果可以为中间偃麦草和长穗偃麦草的细胞学特性和遗传机制的研究提供理论依据。

长穗偃麦草EeHKT1;4基因的克隆与植物表达载体构建

采用RT-PCR方法从长穗偃麦草(Elytrigia elongata)中克隆得到高亲和K+转运蛋白基因,命名为EeHKT1;4,全长cDNA序列为1 977bp,开放阅读框1 722bp,编码573个氨基酸,与一粒小麦(Triticum monococcum)TmHKT1;4-A2的氨基酸同源性为94%。系统进化树分析结果显示,EeHKT1;4与单子叶植物HKT1;4亲缘关系较近。利用In-Fusion技术,成功构建了pBI121-35SEeHKT1;4-Nos植物表达载体,为长穗偃麦草EeHKT1;4的耐盐功能鉴定奠定基础。

长穗偃麦草Actin基因片段克隆及表达模式分析

根据已报道的其他植物肌动蛋白(Actin,ACT)基因的保守序列设计一对简并性引物,以长穗偃麦草根中总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆出ACT基因,命名为EeACT。结果表明,该基因片段长度598 bp,编码198个氨基酸,与其他植物ACT氨基酸序列同源性较高,达90%以上。低温、盐及干旱处理12 h,EeACT在其地上部与根中的表达水平没有显著差异,说明EeACT表达稳定。

过表达长穗偃麦草EeHKT1;4基因增强拟南芥抗旱耐盐性分析

植物高亲和性K^(+)转运蛋白基因(HKT)编码K^(+)、Na^(+)转运或K^(+)-Na^(+)共转运质膜通道蛋白,在植物抗逆过程中发挥重要作用。为了研究长穗偃麦草EeHKT1;4(GenBank:KF956112.1)的功能作用,构建了EeHKT1;4过表达植物表达载体转化拟南芥,进行拟南芥转基因植株的抗旱耐盐性评价分析。结果显示,正常生长条件下野生型(WT)与转基因株系的主根长度无差异,NaCl与甘露醇处理下WT和转基因株系根的生长受到抑制,转基因株系根长度均大于同等胁迫条件下(WT)的根长;正常生长条件下WT与转基因株系表型无显著差异,但在NaCl与甘露醇处理下WT表现出叶片萎缩和植株枯黄,转基因株系仅部分植株表现出叶片萎缩,同一胁迫条件下转基因株系的植株存活率皆高于WT。硝基氮蓝四唑(NBT)与二氨基联苯胺(DAB)染色结果显示,正常生长条件下WT与转基因株系叶片染色相对较浅,随着NaCl与甘露醇浓度提高,所有叶片染色程度逐渐加深且同等胁迫下WT染色程度高于转基因株系。以正常生长条件下基因的表达量为对照,随着NaCl浓度的增加,AtSOS1基因在WT和转基因植株中逐渐上调且在转基因中的表达量高于WT;AtNHX1基因在NaCl处理下上调表达且转基因植株中表达量低于WT,除转基因株系L5外并未检测到WT和转基因株系自身因NaCl浓度的提高AtNHX1基因表达量发生改变;在甘露醇处理下,AtRD29B和AtP5CS1基因均上调表达且转基因植株中表达量高于WT。综上所述,EeHKT1;4过表达降低了逆境胁迫下拟南芥中超氧阴离子和H_(2)O_(2)的积累,诱导抗逆基因上调表达,增强拟南芥抗旱耐盐性。

中间偃麦草、长穗偃麦草及其杂种F_1代同工酶研究

通过对过氧化物酶(POD)、酯酶(EST)、超氧化物歧化酶(SOD)和多酚氧化酶(PPO)同工酶谱的分析,探讨中间偃麦草(Elytrigia elongata(Host)Nevski)、长穗偃麦草(E.intermedia(Host)Nevski)及其杂种F1代的酶谱特征和亲缘关系。结果表明:亲本同工酶酶带数目、迁移率、着色程度等差异不大,二者亲缘关系较近。与亲本相比,杂种F1代存在POD、SOD、PPO酶带丢失现象,但正、反交植株中均产生了一些亲本没有的新生带。杂种F1代EST酶谱与亲本基本相同,仅着色程度略有差异。杂种F1代植株的POD、PPO酶谱特征有偏向中间偃麦草的倾向,而SOD酶谱特征倾向于长穗偃麦草。杂种F1代同工酶具有多态性,可作为遗传标记用于杂种鉴定和后代株系目标性状的选择。

小麦异附加系数量性状的遗传分析

本文根据小麦二体异附加系的细胞遗传学特点和作物数量遗传学原理,提出了对二体异附加系数量性状进行异染色体效应分析和基因效应分析的方法.并分析了小偃麦二体异附加系31505的部分数量性状的异染色体效应和基因效应.

长穗偃麦草细胞质小麦核质杂种农艺性状的研究

长穗偃麦草(Elytrigia elongata=Agropyron elogatum, 2n=70)细胞质小麦核质杂种与核供体进行了比较试验,结果证明:核质杂种株高降低5—8cm,抽穗期略有推迟,抗寒性有明显提高。其它农艺性状,如分蘖数、穗长、穗粒数、结实率等性状没有明显差异。但是在核质杂种中籽粒蛋白质含量增加了11.79%和27.33%,被分析的17种氨基酸含量也有明显提高,提高幅度12.37—53.09%。

小麦×长穗偃麦草的受精和早期胚胎发育

用石蜡切片法，对小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）和长穗偃麦草（Ｅｌｙｔｒｉｇｉａｅｌｏｎｇａｔａ）杂交的受精和早期胚胎发育进行了观察。结果表明，长穗偃麦草花粉在小麦柱头上萌发良好，花粉管可顺利长入花柱和胚囊。观察的１７０个小麦子房中，１７６５％发生了双受精，产生了胚和胚乳；９４１％发生了单卵受精，只产生胚而无胚乳；４７１％发生了单极核受精，只产生胚乳而无胚；总受精率为３１７７％；成胚率为２７０６％。由于胚乳的缺乏或发育异常及败育，最终难以获得有生活力的种子。为小麦与长穗偃麦草远缘杂交提供了细胞胚胎学证据。

矮秆小偃麦异附加系31504的遗传分析──Ⅰ鉴定与细胞遗传

本研究利用细胞学和同工酶电泳等方法对小偃麦二体异附加系３１５０４进行了鉴定；并在不同遗传背景下．分析了异附加染色体的传递特点。结果表明，３１５０４为３Ｆ２／７Ｆ２易位的二体异附加系，其单体异染色体通过胚囊和花粉传递的频率平均分别为２８．９％和２０．２％，且与遗传背景无关。