细胞器应激反应与自噬及铁死亡参与氯化钴诱导的血管平滑肌细胞损伤

目的:综合采用生物信息学分析和体外细胞实验验证,研究化学性低氧诱导剂氯化钴(CoCl2)诱导血管平滑肌细胞损伤与细胞器应激反应及自噬性死亡(自噬)和铁死亡之间的关系。方法:从基因表达数据库(GEO)中获取CoCl2处理血管平滑肌细胞的基因芯片数据集GSE119226,采用R语言分析数据,探讨CoCl2处理与细胞器应激反应(高尔基体应激、内质网应激)及两种细胞死亡方式(铁死亡、自噬性死亡)间的关系。采用原代培养的大鼠血管平滑肌细胞(rVSMC)和CoCl2诱导的体外缺氧模型,CCK-8法检测细胞活力变化,DCFH-DA法检测细胞内活性氧水平,Western blot法检测缺氧关键分子HIF-1α、高尔基体应激标志物GM130与p115、内质网应激标志物GRP78与CHOP、自噬标志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与Beclin1以及铁死亡标志物GPx4与xCT的表达水平,并观察给予相应的处理剂来诱导或抑制细胞器应激反应或细胞死亡对CoCl2诱导的细胞损伤作用的影响。结果:对GSE119226数据集进行差异表达基因筛选分析,结果显示CoCl2处理血管平滑肌细胞对细胞器功能与应激反应、自噬和铁死亡相关基因有明显影响,其中内质网应激、内质网蛋白加工、高尔基体对质膜蛋白转运的调控、自噬/自噬性死亡、铁离子调节与铁死亡等是主要富集的信号通路和生物学过程。体外实验结果显示,与培养的正常对照rVSMC相比,CoCl2处理后细胞活力明显降低,细胞内HIF-1α蛋白表达与活性氧水平升高。CoCl2处理后,rVSMC中反映高尔基体应激发生的高尔基体结构蛋白GM130与p115的表达水平降低,反映内质网应激发生的标志分子GRP78与CHOP升高;同时CoCl2也使细胞自噬标志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与Beclin1水平降低,提示自噬水平降低,而铁死亡标志物GPx4与xCT的表达水平降低则提示细胞发生铁死亡。与CoCl2处理组相比,诱导高尔基体应激、内质网应激或铁死亡可使细胞活力进一步降低,而抑制上述过程可改善细胞活力;另一方面,升高自噬水平可改善CoCl2降低的细胞活力。结论:CoCl2诱导低氧可导致血管平滑肌细胞损伤,高尔基体应激、内质网应激和铁死亡发生以及自噬水平降低在其中起重要作用,抑制细胞器应激反应和铁死亡或升高自噬水平可改善CoCl2导致的血管平滑肌细胞缺氧损伤。

硝酸盐后处理对心肌缺血再灌注损伤过程中内质网应激的影响研究

目的探讨硝酸盐后处理（PPostC）对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）中细胞凋亡的影响，以及特异性内质网应激（ERS）损伤相关蛋向Grp78（葡萄糖调节蛋白78）和Caspase12（半胱氨酸蛋白酶12）的蛋白表达水平的变化和意义。方法Wistar大鼠24只随机分为假手术组、I／R组（缺血再灌注组）、PPostC组（硝酸盐后处理组）三组，每组8只。分别测定各组大鼠心肌缺血和梗死面积、细胞凋亡指数及Caspasel2、Grp78蛋门表达。结果假手术组未见梗死心肌和缺血心肌，PPostC组心肌缺血区面积和梗死区面积均明显小于I／R组[（42．08±4．84）％比（53.31±3．87）％，（38．13±2．05）％比（52．19±3．44）％，P均〈O．01]。假手术组心肌细胞凋亡指数明显低于I／R组和PPostC组[（6．70±2．25）％比（26．92±1．91）％比（20．54±3．05）％，P均〈0．01]。心肌组织Grp78蛋白水平假手术组亦明显低于I／R组和PPostC组，且PPostC组高于I／R组[0．13±0．03比1．04±0．16比1．22±0．11，P均〈0．01]；心肌组织Caspasel2蛋白表达水平假手术组明显低于I／R组和PPostC组，且PPostC组低于I／R组[0．11±0．01比0．41±0．06比0．33±0．04，P均〈0．01]。结论PPostC能减轻心肌细胞凋亡，而ERS激活参与了大鼠MIRI过程，推测PPostC在大鼠MIRI过程中可能通过调节ERS途径抑制细胞凋亡，改善MIRI。

rhPGRN通过MAPK/PI3K通路调控自噬和内质网应激并促进细胞增殖

目的:探讨重组人颗粒体蛋白前体(rhPGRN)对人软骨细胞C28I2和小鼠巨噬细胞RAW264. 7增殖、自噬和内质网应激(ERS)的影响及作用机制。方法:采用Ni-NTA琼脂糖树脂对组氨酸标签蛋白进行特异性亲和纯化,通过考马斯亮蓝染色、BCA法和Western blot验证目的蛋白的浓度和纯度。将细胞随机分为对照组、rhPGRN组、U0126组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、rhPGRN+U0126、rhPGRN+3-MA、rhPGRN+巴弗洛霉素A1(Baf-A1)和rhPGRN+4-苯基丁酸(4-PBA)组,采用细胞计数法、Western blot和RT-qPCR检测rhPGRN对C28I2和RAW264. 7两种不同类型细胞增殖、自噬和ERS的影响。结果:(1)在含有His标签的PGRN稳转细胞株中成功提取高纯度、具有生物活性的人源重组蛋白rhPGRN。(2)rhPGRN能促进C28I2和RAW264. 7细胞的增殖,促进细胞周期相关分子(PCNA、cyclin B1和cyclin D1)的mRNA表达(P<0. 05),上调细胞周期调控蛋白Ki67表达,并提高增殖相关信号分子ERK和Akt蛋白的磷酸化水平(P<0. 05)。(3)ERK通路抑制剂U0126抑制了rhPGRN诱导的细胞增殖、自噬和ERS(P<0. 05);使用3-MA抑制PI3K/Akt通路后,rhPGRN诱导的细胞自噬被显著抑制(P<0. 05);自噬抑制剂Baf-A1和ERS抑制剂4-PBA显著下调了rhPGRN诱导的Ki67蛋白表达(P<0. 05)。结论:rhPGRN通过MAPK和PI3K/Akt通路调控自噬和ERS,从而促进C28I2和RAW264. 7细胞增殖。

HO-1/CO信号通路在大鼠内毒素性急性肺损伤时内质网应激中的作用

目的评价内源性血红素氧合酶-1/一氧化碳(HO-1/CO)信号通路在大鼠内毒素性急性肺损伤(ALI)时内质网应激中的作用.方法健康清洁级雄性SD大鼠40只,体重190~210 g,8周龄,采用随机数字表法分为4组(n=10):对照组(C组)、ALI组、ALI+锌原卟啉-IX组(AZ组)和ALI+溶剂碳酸氢钠组(AV组).采用静脉注射LPS 5 mg/kg的方法制备内毒素性ALI模型.模型制备前30 min时AZ组腹腔注射锌原卟啉-IX10 mol/kg(50 mmol/L碳酸氢钠溶液稀释至1 ml),AV组腹腔注射50 mmol/L碳酸氢钠溶液1 ml.注射LPS 6 h后取颈总动脉血样并处死大鼠取肺组织,测定血浆和肺组织CO水平,光镜下观察病理学结果,并进行肺损伤评分,确定湿重/干重(W/D)比值,采用TUNEL法测定细胞凋亡情况,计算细胞凋亡指数(AI),采用Western blot法检测肺组织HO-1、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、p-PERK、p-elF2a、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及caspase-12的表达水平.结果与C组比较,其余3组肺损伤评分、肺组织W/D比值及AI升高,血浆及肺组织CO水平升高,肺组织HO-1、GRP78、p-PERK、p-elF2a、CHOP及caspase-12表达上调(P<0.05);与ALI组比较,AZ组肺损伤评分、W/D比值及AI升高,血浆及肺组织CO水平降低,肺组织HO-1表达下调,GRP78、p-PERK、p-elF2a、CHOP及caspase-12表达上调(P<0.05),AV组上述各指标差异无统计学意义(P>0.05).结论 HO-1/CO信号通路可能通过抑制内质网应激,对内毒素性ALI大鼠发挥内源性保护作用.

利拉鲁肽下调游离脂肪酸作用下βTC3细胞PERK的表达

目的:探讨游离脂肪酸(FFA)作用下胰岛βTC3细胞双链RNA依赖性蛋白样内质网激酶(PERK)的表达以及利拉鲁肽(Lira)对其表达的干预作用。方法:以βTC3细胞为研究对象,分为对照组和FFA组(0.125,0.25,0.5及1 mmol/L)孵育24 h,Westernblot方法检测PERK的表达。然后,分为对照组,FFA组,和FFA+Lira组(0.5 mg/L和1 mg/L),Lira预孵育6 h后,1 mmol/L FFA继续孵育24 h,Western blot检测PERK的表达。结果:①不同浓度FFA孵育24 h后,与对照组相比,1 mmol/L FFA组PERK表达增加(P<0.05)。②与1 mmol/L FFA组相比,0.5mg/L Lira+1 mmol/L FFA和1 mg/L Lira+1 mmol/L FFA组PERK表达减少(P<0.05),两组之间有统计学差异(P<0.05)。结论:FFA作用能够上调βTC3细胞PERK的表达,而Lira在一定程度上逆转FFA水平异常导致的βTC3细胞PERK表达上调,减轻内质网应激反应。