pEGFP-Kallikrein重组真核表达载体的构建及其在兔内皮祖细胞中的表达

目的:构建携带人组织激肽释放酶(tHK)基因,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体,并导入兔内皮祖细胞(EPCs)中表达,验证tHK基因修饰EPCs用于血管病治疗的可行性。方法:PCR扩增tHK目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N3上,构建重组质粒载体。并利用脂质体转染体外培养的EPCs,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察tHK-EGFP融合蛋白在细胞中的表达;用RT-PCR方法验证tHK在mRNA水平的表达;用ELISA方法验证tHK蛋白水平的表达。结果:酶切和测序证实pEGFP-Kallikrein重组质粒构建正确,重组质粒载体在EPCs中获得了表达,表达的融合蛋白具有tHK和EGFP的双重活性。结论:通过基因克隆方法成功构建了pEGFP-Kallikrein重组质粒载体,并且在EPCs中稳定表达,为进一步研究tHK基因修饰EPCs双重治疗血管病的技术策略奠定了基础。

老年高血压患者微量白蛋白尿与血管内皮功能的关系

目的观察老年高血压患者伴微量白蛋白尿时肾外血管病变的情况,并探讨尿白蛋白排泄率(UREA)与血管内皮功能障碍之间的关系。方法将356例老年高血压患者分为正常对照组(n=177)和微量白蛋白尿组(MA组,n=179),观察其肾外血管病变的发病率,检测内皮功能障碍标志物血管性血友病因子(vWF)、血管内皮素-1(ET-1)的表达水平。结果与正常对照组相比,MA组视网膜病变、周围神经病变、下肢动脉硬化闭塞症的发病率均增高(P均<0.05),血浆vWF水平:正常对照组(118.95±46.72)%,MA组(202.07±73.30)%,两组差异有统计学意义(P<0.01);血浆ET-1水平:正常对照组(50.60±12.39)μg/L,MA组(79.13±14.04)μg/L,两组差异有统计学意义(P<0.01);vWF表达水平与尿白蛋白排泄率呈正相关(r=0.72,P<0.01);ET-1的表达水平与vWF的表达水平呈正相关(r=0.69,P<0.01)。结论伴有微量白蛋白尿的老年高血压患者存在着血管内皮功能障碍,UAER升高的程度可反映内皮功能障碍的程度。

老年糖尿病人餐后甘油三酯、血管活性物质变化对血管内皮功能的影响

目的通过研究餐后高甘油三酯血症与血管内皮依赖性舒张功能、血管活性物质一氧化氮和颈动脉内—中膜厚度之间的关系,探讨老年糖尿病人餐后脂代谢紊乱对血管内皮功能的影响。方法选取空腹血脂正常的老年2型糖尿病患者26例和健康体检者10例进行脂肪餐试验,糖尿病组根据餐后4h甘油三酯是否大于2.0mmol/L分为餐后正常组和餐后增高组,测各时间点血清甘油三酯、一氧化氮和内皮素1水平,高分辨超声检测血管内皮依赖性舒张功能及颈动脉内—中膜厚度。结果餐后正常组和餐后增高组餐后4h甘油三酯差异有显著性(P<0.05),各组一氧化氮、内皮素1与血管内皮依赖性舒张功能及颈动脉内—中膜厚度呈正相关。结论老年糖尿病患者存在餐后脂代谢紊乱,它可导致血管内皮功能受损,促进动脉粥样硬化的发生发展。

胆固醇损伤内皮细胞差异表达基因的生物信息学分析

目的利用差异表达基因克隆方法(抑制消减杂交)获得大量的动脉粥样硬化相关候选基因和表达序列标签后,探讨如何进行后续基因表达及功能的研究。方法利用Internet网络上的数据库及生物学分析软件对胆固醇损伤内皮细胞后获得的差异表达基因进行核酸序列和蛋白质序列分析,探索差异表达基因克隆后的研究方法和思路。结果通过电子延伸得到一个684bp的全长cDNA序列;通过核酸序列分析,该序列定位在线粒体基因组的7587位～8270位,含有一个完整的开放阅读框,编码与氧化磷酸化相关的9个亚基。对其中一个亚基细胞色素氧化酶Ⅱ(COX2)分析得知,细胞色素氧化酶Ⅱ基因编码一段25.6kDa的弱酸性的信号锚蛋白,细胞色素氧化酶Ⅱ蛋白的三维结构是一个典型的椅式结构,它含有一段疏水区域,一个跨膜结构域和一个胞质结构域。运用蛋白的进化分析,得知细胞色素氧化酶Ⅱ蛋白胞质结构域的氨基酸序列在进化过程中高度保守。结论生物信息学技术是一种高效的获取疾病相关基因信息的方法,利用生物信息学方法对细胞色素氧化酶Ⅱ基因进行分析,获得了基因及其编码蛋白的相关信息,该蛋白参与电子传递,可能与细胞的氧化应激有关。

肺炎衣原体感染对高脂血症小鼠主动脉内皮细胞过氧化体增殖物激活型受体γ、P50和c-Fos表达的影响

目的探讨肺炎衣原体感染对高脂血症小鼠主动脉内皮细胞过氧化体增殖物激活型受体γ、核因子κB和激活蛋白1表达的影响。方法48只C57BL/6J雌性小鼠分成对照组、感染组、高脂组和感染高脂组。14周后,通过间接免疫荧光标记法检测主动脉内皮细胞过氧化体增殖物激活型受体γ、P50(核因子κB亚单位)和c-Fos(激活蛋白1亚单位)表达情况。用苏丹Ⅳ对主动脉窦冰冻切片进行脂染色以检测主动脉窦动脉粥样硬化病灶情况并进行评分。结果主动脉窦动脉粥样硬化病灶评分在对照组和感染组无升高,而在高脂组和感染高脂组显著升高(P<0.01),且感染高脂组和高脂组相比差异有显著性(P<0.01)。和对照组相比,感染组、高脂组和感染高脂组小鼠主动脉内皮细胞过氧化体增殖物激活型受体γ、P50和c-Fos的表达是升高的,而在感染组、高脂组和感染高脂组3组之间过氧化体增殖物激活型受体γ、P50和c-Fos的表达差异无显著性。结论在肺炎衣原体感染和高脂血症的早期,小鼠主动脉内皮细胞的炎症通路已经激活。单独肺炎衣原体感染不能引起动脉粥样硬化的形成,但肺炎衣原体感染能加速高脂饮食引起的动脉粥样硬化形成。