细菌内毒素检查法评审要点与注册资料常见问题分析

通过梳理细菌内毒素检查法建立的关键步骤,对细菌内毒素限值制定、MVD或MVC的计算、实验材料、实验过程和质量标准等涉及的评审要点进行了归纳总结,对评审过程中发现的常见问题进行了分析,以期为新兽药生产企业制定相应产品的细菌内毒素检查方法提供参考。

注射用单磷酸阿糖腺苷细菌内毒素检查方法研究

目的:建立注射用单磷酸阿糖腺苷的细菌内毒素检测方法并进行方法学验证,以期对该品种的质量控制标准进行统一规范。方法:按照《中国药典》2020年版四部通则1143“细菌内毒素检查法”,确定细菌内毒素的限值,进行干扰试验,并进行内毒素检查。结果:按经验拟定的限值标准(每1mg单磷酸阿糖腺苷中含内毒素的量应小于0.06EU)对15个厂家提供的25个批次的供试品进行细菌内毒素检查,结果均符合规定。结论:本文建立的细菌内毒素检查法检查,可用于注射用单磷酸阿糖腺苷的质量控制。

LAL test and RPT for endotoxin detection of CPT-11/DSPE-mPEG_(2000) nanoformulation: What if traditional methods are not applicable?

Endotoxin detection is an important step in drug characterization. Herein we found that a chemotherapeutic drug nanoformulation composed of irinotecan hydrochloride(CPT-11) and an amphiphilic molecule DSPE-mPEG_(2000) can interfere with the limulus amebocyte lysate assay(LAL). Furthermore, the rabbit pyrogen test(RPT) results indicated that at a relatively high dosage, the drug irinotecan hydrochloride can induce a hypothermia effect which may render the RPT results ambiguous in determination of the safety of the drug formulation.Our findings demonstrate limitations of endotoxin detection in micellar drugs,and call for the necessity of developing reliable endotoxin detection methods that can overcome the interference of nanomaterials in order to better ensure the drug safety of patients in future pharmaceutical drug development.

Expi293F表达重组鲎C因子用于荧光法内毒素检测

鲎C因子是一种对痕量内毒素高度敏感的丝氨酸蛋白酶原,在医药行业可替代鲎试剂用于内毒素检测。然而其重组表达困难,且对于环境中内毒素的控制要求极高。该文首先克隆了来源于东方鲎的全长C因子,并在N末端和C末端分别添加了Flag标签和6×His标签,同时用哺乳细胞表达载体中的分泌信号肽替换掉了原始C因子信号肽。构建好的重组质粒转染至人胚胎肾脏细胞Expi293F悬浮培养7 d后收获上清液,Western Blot检测蛋白与预测大小128 kDa一致,具有与内毒素结合以及结合后切割荧光底物的能力。该研究首次在人胚胎肾脏细胞Expi293F中成功表达出具有生物学活性的全长C因子,表达量达到19.18 mg/L,比DING在昆虫细胞SF9中的表达量提高了113%。该方法对于后续开发低成本内毒素检测试剂盒具有指导意义。

检验用鲎试剂及重组试剂的现状与思考

目的通过研究检验用鲎试剂及重组试剂的使用及管理现状,为细菌内毒素检测和鲎试剂使用的科学有序发展提供参考。方法结合日常医疗产品检测和管理工作实践,梳理检测用鲎试剂的相关历史沿革和国内外监管现状,分析在鲎资源短缺情况下,细菌内毒素检测主要替代方法及其所用重组试剂的基本情况。结果与结论对目前在无菌医疗产品细菌内毒素检测领域可能面临的原材料短缺、监管方式有待进一步完善等主要问题进行总结,建议明确鲎试剂的管理归属、对医疗产品检验用鲎试剂的质量标准开展标准提高及生产质量管理的研究工作、加强鲎试剂检测替代方法相关试剂的监管等。

国内外细菌内毒素能力验证项目的比较研究

目的通过对比分析国内外细菌内毒素能力验证方案与结果,总结能力验证方案设计经验,提高实验室细菌内毒素检测质量控制水平,从而丰富药品质量检测手段。方法分别介绍欧洲药品质量管理局,美国查尔斯河实验室、中国食品药品检定研究院组织的细菌内毒素能力验证计划内容,讨论分析待测样本来源与满意度和结果评估方案的关联性。结果各机构组织的能力验证各有特色,采用真实样品和多个待测样本作为能力验证样品,比标准内毒素样品检测满意率较低。结论建议细菌内毒素检测能力验证采取多种模式,能力验证方案应重视采用真实样品进行,加强针对细菌内毒素检测不确定度的研究。进一步提高国内细菌内毒素检测能力验证水平,保证内毒素的检测准确可靠性,从而保障注射剂相关药品的质量安全。

重组C因子法在医疗器械细菌内毒素检测中的应用前景

细菌内毒素是主要的致热原,进入人体血液循环会引起体温升高和炎性反应。临床上偶尔会发生因医疗器械内毒素不合格而引起的不良事件,故对医疗器械进行严格的细菌内毒素检测是保障患者安全的关键。然而,传统的细菌内毒素检测方法存在局限性,因此需要探索更科学有效的检测方法。为了保障医疗器械的安全性,该研究深入探讨了重组C因子法(rFC)在细菌内毒素检测中的优势,分析其在医疗器械检测领域的应用前景,并为该方法的顺利推广和应用提出可行性建议。

微量凝胶法测定细菌内毒素探讨

目的 建立测定样品中细菌内毒素的微量凝胶法。方法 按2020年版《中国药典(四部)》1143细菌内毒素检查法进行试验,通过预试验确定适合试验的试管内径(4,8 mm)及加样量(10,20,30,40,50,60,70μL)后,再进行完整的鲎试剂灵敏度复核试验及样品细菌内毒素检查试验,并与药典收载现行凝胶法进行比较。结果 预试验结果显示,确定采用内径为8 mm的平底玻璃试管,加样量为40μL或50μL进行微量凝胶法试验。对鲎试剂进行灵敏度复核,微量凝胶法灵敏度复核结果与药典收载现行凝胶法一致,均在灵敏度合格范围内。对样品进行细菌内毒素检查,微量凝胶法试验结果与药典收载现行凝胶法一致。结论 该微量凝胶法可作为药典收载现行凝胶法的补充或替代方法,鲎试剂缺乏的情况下可用于灭菌制剂的细菌内毒素检查。

氟马西尼原料药中细菌内毒素检查

目的 建立氟马西尼原料药中细菌内毒素的检查方法。方法 依照2020年版《中华人民共和国药典(四部)》通则1143细菌内毒素检查法,用二甲亚砜(DMSO)溶解氟马西尼,再用细菌内毒素检查用水(BET水)稀释,用凝胶法和动态浊度法进行干扰实验和内毒素回收实验。结果 氟马西尼原料药加入DMSO溶解,制成浓度为10 mg·mL^(-1)的溶液,再用BET水稀释100倍及以上时对细菌内毒素检查法无干扰作用。结论 所建立的细菌内毒素检查方法可用于氟马西尼原料药的细菌内毒素检查,控制其产品质量。

双价人乳头瘤病毒疫苗(毕赤酵母)细菌内毒素检查方法的建立

目的建立双价人乳头瘤病毒疫苗(毕赤酵母)的细菌内毒素检查方法。方法按《中国药典》2020年版三部通则1143细菌内毒素检查法及四部指导原则9251“细菌内毒素检查法应用指导原则”中的相关规定进行凝胶法、光度法(动态浊度法和动态显色法)测定细菌内毒素方法学研究。结果双价人乳头瘤病毒疫苗(毕赤酵母)经40倍及以上稀释,对凝胶法反应无干扰,同时动态浊度法及动态显色法回收率也可达到要求。结论建立双价人乳头瘤病毒疫苗(毕赤酵母)的凝胶法、动态浊度法及动态显色法进行细菌内毒素检查可行。

硫酸特布他林原料药细菌内毒素检查方法学研究

目的:建立硫酸特布他林原料药细菌内毒素的检查方法。方法:采用凝胶法对硫酸特布他林进行方法学验证,并对三批样品进行了干扰试验和细菌内毒素检查。结果:可用于细菌内毒素检查的硫酸特布他林原料药,限值定为“每1 mg硫酸特布他林中含内毒素的量应小于0.50 EU”。结论:鲎试剂凝胶法可用于硫酸特布他林原料药细菌内毒素检查。

地塞米松植入剂细菌内毒素检查方法的建立

目的建立地塞米松植入剂细菌内毒素检查方法并进行验证。方法地塞米松植入剂混悬液加入二甲亚砜溶解混匀,再用细菌内毒素检查用水稀释,依照《中国药典》2020年版(四部)通则1143细菌内毒素检查法,采用2个厂家的鲎试剂进行凝胶法干扰试验和内毒素回收验证,并对地塞米松植入剂进行细菌内毒素检查。结果在本试验验证条件下,先用二甲亚砜溶解再用细菌内毒素检查用水稀释地塞米松植入剂至40倍浓度时,不干扰鲎试剂与内毒素的酶联反应。结论地塞米松植入剂可用细菌内毒素检查法进行质量控制。

注射用三磷酸胞苷二钠细菌内毒素检查法的研究

目的建立注射用三磷酸胞苷二钠细菌内毒素检查方法。方法按《中国药典》2020年版四部通则1143细菌内毒素检查法,从严确定注射用三磷酸胞苷二钠的限值,用凝胶法进行方法学验证和细菌内毒素检查。结果两个厂家的4批供试品在0.2 mg/ml浓度下对两个厂家的鲎试剂不存在干扰,细菌内毒素的限值设定为2.5 EU/mg,4批注射用三磷酸胞苷二钠细菌内毒素的检查结果均符合规定。结论本研究建立的细菌内毒素检查方法可用于替代家兔热原检查法,满足对注射用三磷酸胞苷二钠的质量控制要求。

盐酸倍他司汀注射液细菌内毒素方法学研究

目的:研究盐酸倍他司汀注射液细菌内毒素质量控制方法。方法:对5个厂家23批次的盐酸倍他司汀注射液进行细菌内毒素凝胶检查法的方法学研究。结果:本品内毒素限定值为3 EU•mg^(-1),适用《中国药典》2020年版四部通则1143项细菌内毒素检查法检查。结论:盐酸倍他司汀注射液可用细菌内毒素检查法进行质量控制,其细菌内毒素限值可以定为:每1 mg盐酸倍他司汀中含内毒素的量不得超过3.0 EU。

唑来膦酸原料细菌内毒素检查方法学研究

目的:建立唑来膦酸原料细菌内毒素的检查方法。方法:依据2020年版《中国药典(四部)》附录1143建立唑来膦酸原料细菌内毒素的检测限。结果:唑来膦酸原料药在≤0.05 mg/m L时对细菌内毒素检查方法无干扰。结论:唑来膦酸原料的细菌内毒素限值可设定为10 EU/g。

动态浊度法定量检测能力验证样品中细菌内毒素含量及分析

检测能力验证样品中细菌内毒素的含量和分析检测过程的注意事项。依据《中国药典》2020年版4部通则1143细菌内毒素检查法的光度测定法中的动态浊度法。建立细菌内毒素检查的标准曲线,通过预实验确定样品最佳稀释倍数及预估细菌内毒素含量,并选定最佳稀释倍数对样品中细菌内毒素含量进行独立平行3次检测。细菌内毒素检测浓度线性范围为0.0625~1.0EU/mL,标准曲线为LgT=2.8059+(-0.28966LgC)(|r|值=0.9982);样品在稀释1000倍时对试验无干扰作用;细菌内毒素回收率50%~200%;3次平行检测结果 T1、T2、T3分别为83.80 EU/mL、82.70 EU/mL、83.00 EU/mL。动态浊度法测定该能力验证样品的检测方法可靠、结果准确、稳定。

利福平原料细菌内毒素检查方法的建立

目的确定合理的内毒素限值,建立利福平原料细菌内毒素检查方法。方法计算出利福平原料合理的内毒素限值。而后按照《中国药典》2020年版四部通则1143细菌内毒素检查法中的凝胶法。对3批原料样品采用2个厂家的鲎试剂进行干扰试验,对利福平原料细菌内毒素进行方法学验证。结果结合临床用药利福平原料内毒素限值设置在0.5 EU/mg。实验中供试品采用甲醇溶解,稀释至质量浓度不大于0.5 mg/ml时,对细菌内毒素试验结果无干扰。结论建立利福平原料的细菌内毒素检查方法,更有利于成品质量控制和用药安全。

氢氧化铝佐剂细菌内毒素凝胶法检测方法验证

目的:建立氢氧化铝佐剂的鲎试剂凝胶法检测方法。方法:按《中国药典》2020版通则1143细菌内毒素检查法,采用3种缓冲液、钙镁离子添加剂正交设计进行干扰预试验;2个厂家的鲎试剂对不同批号氢氧化铝佐剂进行干扰试验、样品处理的有效性验证。结果:通过干扰预试验,筛选到排除干扰条件。在验证条件下,氢氧化铝佐剂以PBS缓冲液、钙镁离子添加剂排除干扰,对细菌内毒素检查法无干扰作用。结论:建立的凝胶法检测方法用于检查氢氧化铝佐剂的细菌内毒素可行。

磺胺二甲嘧啶钠注射液和磺胺间甲氧嘧啶钠注射液细菌内毒素检查方法的改进研究

对磺胺二甲嘧啶钠注射液和磺胺间甲氧嘧啶呐注射液的细菌内毒素检查方法的拟定标准进行了改进,通过固定浓度的盐酸溶液溶解供试品,再使用无热原滤膜过滤的方法排除了干扰。通过上述供试品前处理方法的改进,检验人员无需采用特殊灵敏度的鲎试剂,亦可完全消除干扰作用,增强了标准的可执行性。

重组C因子法检测4种生物制剂中细菌内毒素的方法学研究

目的:考察重组C因子法对生物制剂适用性,建立该方法检测细菌内毒素的质量标准。方法:选取2种代表性的生物重组制剂和2种单克隆抗体制剂,进行重组C因子干扰试验,并用原标准规定的细菌内毒素检查法进行对比实验。按照《中国药典》2020年版四部附录1143细菌内毒素检查法干扰试验的规定,与原检测法的结果进行对比。结果:4种生物制剂回收率均在《中国药典》规定的50%~200%范围内,符合药典规定,并与原实验结果一致。结论:本研究为重组C因子检测生物制剂中的细菌内毒素的方法学和标准的建立提供了实验依据。