温氏附红细胞体16S rRNA基因的序列测定和分析

从自然感染附红细胞体的湖北黄牛无菌采集血液,分离附红细胞体并提取病原基因组,用血营养菌的16SrRNA基因的通用引物进行PCR扩增,得到长约1.5 kb的扩增片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行测序和分析。结果表明该片段全长为1 471 bp(GenBank收录号为AY946266),同源性分析表明该序列与Neimark公布的温氏附红细胞体(AF016546)的16S rRNA基因序列同源性达到98.7%,证实该病原为温氏附红细胞体,从分子生物学水平证实了温氏附红细胞体在湖北省的存在。将该序列与5种支原体、14种血营养菌及边缘无浆体等的相应序列进行比较,建立系统发育树,结果表明温氏附红细胞体同边缘无浆体的关系较远,而与肺炎支原体组的亲缘关系较近。

温氏附红细胞体部分16S rRNA基因的序列测定和分析

从确诊为附红细胞体感染的黄牛无菌采集血样,抽提附红细胞体基因组DNA,用实验设计的能扩增多种动物血营养菌部分16SrRNA基因的通用引物进行PCR扩增,结果扩增出大小约为370bp的DNA片段。PCR产物序列测定和系统进化分析显示,实验获得的核苷酸序列为温氏附红细胞体的16SrRNA基因,与国外报道的温氏附红细胞体的同源性为97%。反映出不同地理株的温氏附红细胞体存在一定的遗传差异,为牛附红细胞体病的诊断和分子流行病学研究提供科学依据。

温氏附红细胞体病PCR诊断方法的建立及其应用

为建立特异、敏感、快速的温氏附红细胞体诊断方法,根据温氏附红细胞体16S rRNA基因序列(GenBank登录号为AY946266),设计1对种特异性引物,建立了温氏附红细胞体的PCR诊断方法。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法能特异性地扩增温氏附红细胞体16S rRNA基因序列的特异性片段,检测温氏附红细胞体最低DNA量为0.178 fg。利用该方法对湖北省、江苏省和黑龙江省温氏附红细胞体病感染情况进行了流行病学调查,结果显示阳性感染率分别为10.3%、5.3%、45.8%,说明温氏附红细胞体在湖北省、江苏省和黑龙江省均存在,流行病学调查显示湖北省感染率较高、流行较广。

温氏附红细胞体对奶牛免疫水平的影响

选择5头感染温氏附红细胞体的奶牛和5头健康奶牛,分别进行红细胞C3b受体花环率、免疫复合物花环率、B淋巴细胞EA花环率、外周血中T淋巴细胞百分率、淋巴细胞转化率的测定。结果表明,感染温氏附红细胞体的奶牛其红细胞C3b受体花环率、免疫复合物花环率、B淋巴细胞EA花环率、外周血中T淋巴细胞百分率、淋巴细胞转化率明显低于健康奶牛,且二者在0.01水平上有差异。这说明温氏附红细胞体对奶牛的免疫水平有明显的抑制作用。

新疆规模化牛场温氏支原体(附红细胞体)的调查

为了解新疆两个规模化牛场温氏支原体(附红细胞体)的流行情况,本研究采集了不同年龄段牛(<6月龄犊牛、后备母牛、成年母牛、育肥牛)的血液样品共152份,利用PCR方法扩增血液样品中的温氏支原体16S rRNA部分基因序列,两个牛场各选取3份PCR产物测序后分析其与温氏支原体参考株(AF016546)的同源性并统计温氏支原体的感染情况;采用Mega7.0软件对扩增出的16S rRNA部分基因与Genbank数据库里登录的温氏支原体分离株相应基因序列构建进化树分析其遗传进化关系;利用相关性检验分析牛特征性临床症状与温氏支原体阳性检出率的相关性。结果显示,152份血液样品中有59份样品扩增出约750 bp的目的基因片段。测序分析结果显示本研究获得的16S rRNA基因序列与温氏支原体分离株FJ375309.1、MG948625.1的16S rRNA基因序列同源性达100%,与温氏支原体参考株(AF016546)同源性达99.16%。结果表明,59份血液样品检测到温氏支原体,阳性检出率为38.82%(59/152),A场阳性检出率为65.0%(52/80),B场阳性检出率为9.7%(7/72)。不同年龄段牛的阳性检出率分别为:成年母牛(13.82%,21/152)>后备母牛(13.15%,20/152)>育肥牛(7.89%,12/152)>犊牛(3.95%,6/152)。系统发育树显示,本研究所测的16S rRNA基因序列与温氏支原体中国丰都分离株(FJ375309.1)亲缘关系最近。相关性检测结果显示,温氏支原体阳性检出者与其临床症状(主要是消瘦、贫血)呈弱相关性。阳性检出率较高的成年母牛和后备母牛为温氏支原体在规模化养殖场的持续流行提供了传染源。本研究证实了温氏支原体在新疆规模化牛场的流行。

重庆地区牛附红细胞体16S rRNA基因部分序列的测定和分析

目的对牛附红细胞体的16SrRNA基因序列进行测定和系统进化分析。方法无菌采取感染附红细胞体的黄牛、奶牛、水牛血液,提取附红细胞体的基因组DNA,根据GenBank公布的奶牛附红细胞体16SrRNA序列设计的特异性引物进行PCR扩增,并对PCR产物进行序列测定和系统进化分析。结果PCR扩增出的DNA片段均为415bp左右。序列测定和系统进化分析显示,三者间的相似度分别为(黄牛:水牛=99.52%;黄牛:奶牛=99.28%;奶牛:水牛=99.76%)。与GenBank上公布的Mycoplasma wenyonii(武汉株)序列比较存在有4个突变位点,相似度均>98%。结论表明本次在重庆地区从牛体分离的附红细胞体为温氏附红细胞体。

龙井和珲春市牛附红细胞体感染情况调查

采用压滴镜检法和血涂片染色法,检测龙井和珲春地区牛附红细胞体感染情况.共检测21头牛,检出率为100%,比较2种方法,检测出的附红细胞体平均感染率分别为55.25%,58.52%,2个地区附红细胞体的平均感染率分别为66.58%,55.11%;采用压滴镜检法检测,表现临床症状的牛与不表现临床症状的牛的附红细胞体平均感染率比为56.22∶29;放养牛与圈养牛的附红细胞体平均感染率比为59.72∶8.

牛附红细胞体16SrRNA基因的克隆测序及分析

无菌采集自然感染附红细胞体的牛血液,提取全血基因组,用血营养菌16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增,得到长约1500 bp的扩增片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行测序和分析。结果,所克隆的牛附红细胞体基因片段大小为1 454 bp,GenBank登录号为FJ375309(丰都株)。序列比对结果显示,牛附红细胞体丰都株与武汉株(AY946266)最高,达99.7%,与支原体科代表种同源性为60.7%～76.2%,而与立克次氏体科的立克次氏体和无形体科的无形体同源性仅为51.4%～56.4%,表明牛附红细胞体应归为支原体科,附红细胞体属,而不应属于立克次氏体目,无浆体科。对国内外牛温氏附红细胞体的亲缘关系分析表明,牛温氏附红细胞体无明显的地域性差别趋势。