大肠杆菌甘露糖-6磷-酸异构酶基因(manA/pmi)的克隆及功能鉴定

甘露糖-6-磷酸异构酶基因(pmi/manA)是当前植物转基因工程的重要选择标记基因,在生物安全上被认为是无害的。根据同源序列从大肠杆菌DH10B基因组中克隆出pmi基因。通过诱导原核表达获得PMI目的蛋白,对粗提和经过镍柱纯化的PMI蛋白进行Western分析和酶活反应鉴定。以上结果表明,PMI蛋白成功诱导,其分子量为46kDa,纯化过的PMI具有高的酶活性,能催化甘露糖-6-磷酸发生异构反应生成果糖-6-磷酸。同时利用pmi基因作为选择基因构建植物表达载体pCPMi,通过农杆菌介导法转化烟草获得转基因植株,PCR检测结果表明96个再生植株有72株为阳性。以上结果表明,克隆的pmi基因具有高的酶活性,并能作为转基因植物的一种选择标记,同时也为转基因植物提供安全的选择标记基因,便于转基因植物的推广。