肠致病性大肠埃希菌EspB基因的体外诱导表达研究

目的:研究肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)EspB基因的体外诱导表达情况,获得纯化的EspB蛋白。方法:体外构建重组质粒pET-28a-EspB,转化BL21感受态细菌培养,提取重组质粒并行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。重组质粒pET-28a-EspB经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹试验(Western blot)分析。pET-28a-EspB表达产物再次经纯化,获得的纯化蛋白进一步经SDS-PAGE和蛋白质Western blotting分析验证。结果:经双酶切和测序验证pET-28a-EspB重组质粒构建成功。pET-28a-EspB重组质粒经IPTG诱导后,在诱导表达不同时间点,培养菌液、沉淀和上清中均有良好的蛋白表达。经SDS-PAGE和蛋白质Western blotting分析验证我们获得了纯化的EspB蛋白。结论:体外可成功诱导EPECEspB蛋白稳定高效表达并获得纯化EspB蛋白产物。

肠出血性大肠杆菌毒力相关基因突变株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、espB、espD,构建3株突变株。方法:以肠出血性大肠杆菌O157∶H7为模板,PCR扩增基因两翼的同源序列;将PCR产物插入pEASY-T1载体并测序,将测序正确的上、下游同源序列分步酶切,构建于pUC19-kan质粒上,经PCR获得两端同源序列中间嵌合卡那霉素抗性基因标记的线性片段,利用质粒pKD46介导的重组技术,敲除espA、espB、espD基因,之后转入pCP20质粒以去除抗性标记,最后测定突变株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、es pB、espD,获得3株突变株,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:为进一步研究espA、espB、espD基因在肠出血性大肠杆菌O157∶H7致病过程中的作用奠定了基础。