表达重组人红细胞生成素细胞株的高密度、高表达培养

目的；用生物反应器培养能表达重组人红细胞生成素的工程细胞，使其在到高密度高表达。方法：先将工程细胞在含有５％胎牛血清的ＤＭＥＭ－Ｆ１２培养基中培养，待细胞总数在到２×１０＾８个以上时，接种到５Ｌ生物反应器中，用含有血清的培养基培养７ｄ后转为无血清ＣＨＯ专用培养基，继续培养３０ｄ。在整个培养过程中，采用流加的方式连续培养，根据情况随时测定培养基中葡萄糖浓度，使其保持高于０．５ｇ／Ｌ。

骨髓增生异常综合征患者EPO水平的测定及其受体的表达

目的研究骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓促红细胞生成素受体(EPOR)的表达以及血清促红细胞生成素(sEPO)水平与临床的关系,为MDS患者贫血采用EPO治疗提供理论依据。方法对45例MDS患者采用RT-PCR法检测EPOR的表达,以夹心酶联免疫法(ELISA)测定sEPO含量,按照WHO分类诊断标准分类,其中低危组20例,包括难治性贫血(RA组)11例、难治性血细胞减少伴多系发育异常(RCMD组)9例;高危组25例,包括难治性贫血伴原始细胞增多-1(RAEB-1组)10例、难治性贫血伴原始细胞增多-2(RAEB-2组)15例。结果 45例MDS患者有25例表达EPOR,低危组患者的EPORmRNA平均表达量为0.686 2±0.372 5,与对照组无显著差异(P>0.05),高危组患者EPORmRNA平均表达量为0.402 3±0.138 5,显著低于对照组0.834 7±0.254 1(P<0.05)。低危组患者sEPO平均含量为(13.91±7.70)IU/L,显著低于对照组(20.57±9.06)IU/L(P<0.05);高危组sEPO平均含量为(30.68±14.08)IU/L,显著高于对照组(20.57±9.06)IU/L(P<0.05)。结论 sEPO水平减低在低危组起重要作用;高危组EPOR表达降低或缺失,但sEPO水平显著升高,表明EPOR表达水平降低为高危MDS患者红系异常的主要原因,对MDS患者临床采用EPO治疗具有指导意义。

酶联免疫吸附法测定肿瘤性贫血患者的血清细胞因子水平及其发病机制研究

目的研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、红细胞生成素(EPO)、干扰素-γ(IFN-γ)对肿瘤性贫血(CRA)的作用机制。方法将恶性肿瘤患者分为试验组(肿瘤伴贫血,76例)和对照组(肿瘤无贫血,21例);再将试验组患者照铁代谢参数分为试验Ⅰ组(29例)和试验Ⅱ组(47例),另选择50例健康志愿者作为正常组。用放射免疫法检测各组血清EPO、铁蛋白(SF)水平,以酶联免疫吸附试验检测血清TNF-α、IFN-γ水平。抽取正常骨髓,常规培养,分别加入不同浓度TNF-α、IFN-γ,对骨髓红细胞集落生成单位(CFU-E)计数;培养体系中再加入不同浓度的重组人促红素(rhEPO),对各浓度时CFU-E进行计数。结果试验Ⅰ组、试验Ⅱ组及对照组的血清TNF-α分别为(137.8±13.2),(241.4±19.8),(113.7±12.6)ng·L^(-1);这3组的EPO分别为(513.7±37.1),(268.8±21.9),(94.6±11.4)ng·L^(-1);这3组的IFN-γ分别为(191.5±16.5),(289.7±20.3),(157.9±14.7)ng·L^(-1)。这3组的这3种指标均显著高于正常组的(51.3±8.4),(56.8±7.1),(57.4±7.8)ng·L^(-1),差异有统计学意义(均P<0.05);同时,试验Ⅱ组血清EPO显著高于对照组,但显著低于试验Ⅰ组,差异有统计学意义(P<0.05)。体外细胞培养结果显示,TNF-α、IFN-γ均对正常骨髓CFU-E具有抑制作用,与浓度有依赖性且呈正相关;在培养体系中加入rhEPO,能够改善TNF-α、IFN-γ的抑制作用;在2×10^(-10)~32×10^(-10)mol·mL^(-1)内,rhEPO浓度越高,这种改善作用越明显,但依然无法恢复至正常水平。结论在TNF-α、INF-γ等细胞因子作用下,骨髓红系对EPO的反应性不足,这可能是肿瘤性贫血的发病机制之一。

红细胞生成素对人单核细胞hepcidin的影响及其机制

目的探讨红细胞生成素（EPO）对单核细胞hepcidin的影响及典分子学机制.方法采用实时定量PCR和Western blot方法检测hepcidin及信号分子C／EBPα、Smadl／5／8、磷酸化（p）-Smadl／5／8和p-STAT3的表达水平。采用IL-6或脂多糖（LPS）刺激人单核细胞系THP-1细胞，脱祭EPO对THP-1细胞hepcidin及信号分子表达的影响。加入EPO受体（EPOR）的抗体，观察其对EPO的拮抗作用以及对信号分子的影响。结果EPO能抑制由20ng／ml IL-6或1μg/ml LPS诱导的THp-1单核细胞hepcidin mRNA表达，作用呈时间和浓度限制性，EPO2U／ml（降低56％或64％）、作用6h（降低53％或66％）抑制作用最明显。在20ng／mlIL-6诱导作用下，EPO还町抑制hepcidin蛋白表达，EPO2U／ml作用6hhepcidin蛋白表达明显降低。同时信号分子C／EBPα、p-Smadl／5／8和p-STAT3表达也受抑制，EPOR抗体能够拮抗EPO对hepcidin以及上述信号分子的抑制作用。结论EPO可以抑制IL-6或LPS诱导的单核细胞hepcidin表达；在体外，EPO可能足通过下测C／EBPα、p-SmadI／5／8和p-STAT3进而抑制单核细胞hepcidin表达。