人可溶性白介素-1受体真核表达载体pcDNA3/sIL-1R的构建

目的 本研究旨在构建人可溶性白介素_1受体 (sIL_1R)真核表达载体pcDNA3 sIL_1R ,为研究骨关节病的基因治疗奠定实验基础。方法 将人sIL_1R基因的RT_PCR纯化产物及质粒pcDNA3 1(+)DNA经KpnI和XhoI双酶切、胶回收纯化酶切片段后 ,体外连接酶切片段 ,使其定向重组 ,再将重组DNA转化E .coliCompetentCellsJM10 9,经复苏后 ,在含Ampr 的LB固体培养基上筛选出阳性克隆。结果 挑取的LB固体培养基上的 6个单菌落经酶切及测序鉴定 ,证实均为阳性克隆 ,即sIL_1R与pcDNA3 1(+)体外重组成功。结论 采用体外重组技术 ,成功地将人sIL_1RcDNA插入了真核表达载体pcDNA3 1(+)

HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的 设计并合成人8 羟基鸟嘌呤 DNA糖苷酶(HOGG1)特异性的锤头状核酶(hammerheadribozyme)基因并构建其真核表达载体。鉴定含有核酶靶基因HOGG1cDNA保守序列的真核表达载体。方法 运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ) ,将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3 1中,重组子由BamHI和EcoRI酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。含有HOGG1基因cDNA保守序列的真核表达载体经BamHI和EcoRI酶切电泳鉴定。结果 RZ人工合成后与pcDNA 3 1连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI位点之间,命名为pcDNA 3 1 RZ。1 3kb的HOGG1基因cDNA保守序列准确克隆于pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI酶切位点之间,命名为pcDNA 3 1 HOGG1。结论 成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的真核表达载体。

pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体的构建

从胰腺癌PaTu8988S细胞中提取总RNA,并克隆AKR1B10基因,构建pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体。转化感受态大肠杆菌DH5α细胞,提质粒,酶切及测序鉴定,pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体构建成功。

鼠白细胞介素3真核表达质粒的构建及鉴定

利用鼠白细胞介素 3 ( IL - 3 )基因构建真核表达质粒 ,筛选获得的阳性克隆经限制性内切酶酶切鉴定和基因测序 ,证明小鼠 IL - 3基因正确克隆到 p CDNA3真核表达载体上 ;将获得的真核表达质粒 p CDNA3IL - 3转化大肠杆菌细胞 ,增菌培养后大量提取 p CDNA3IL- 3质粒 ,经紫外分光光度计检测其纯度和浓度 ,用于小鼠抗生育 DNA疫苗免疫小鼠模型的免疫增强佐剂。

人端粒酶催化亚单位(hTERT)特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的设计并合成人TERT特异性的锤头状核酶(hammerhead ribozyme)基因并构建其真核表达载体。含有核酶靶基因hTERTcDNA保守序列的T载体pMD18-T-hTERT的构建。方法运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ),将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3.1(+)中,重组子由BamH I和EcoR I酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序。RT-PCR法扩增目的基因cDNA保守序列,与pMD-18进行T-A连接,重组子经菌液PCR及测序鉴定。结果RZ人工合成后与pcDNA 3.1(+)连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3.1(+)的BamH I和EcoR I位点之间,命名为pcDNA 3.1-RZ。220bp的hTERT基因cDNA保守序列准确克隆于pMD18-T,命名为pMD18-T-hTERT。结论成功合成hTERT特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的pMD18-T-hTERT载体。