蜜蜂蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测蜜蜂欧洲幼虫腐臭病(EFIB)病原菌蜂房蜜蜂球菌(M.pluton)的方法,本研究根据M.pluton 16S rRNA基因序列,设计并合成特异性引物和TaqMan探针,经反应参数优化,建立了检测M.pluton TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该方法与其它蜜蜂常见病病原均无交叉反应;该方法的灵敏度为1.0×10~1拷贝/μL的阳性质粒,比普通PCR灵敏1 000倍;重复性试验表明该方法的批内和批间变异系数均小于1%。应用该方法对100份实验室模拟样品和150份临床样品进行了检测,与预期结果一致。本研究建立的方法可为蜂及蜂产品中M.pluton的检验检疫提供新的、有效的技术手段。

浙江省淳安县中华蜜蜂囊状幼虫病毒与蜂房球菌感染情况调查

为了解浙江省淳安县中华蜜蜂囊状幼虫病和欧洲幼虫腐臭病病原[中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)和蜂房球菌(Melissococcus pluton)]全年流行情况,于2019年1月—12月采集淳安县5个饲养点的中蜂工蜂,并采用聚合酶链式反应检测方法,监测这2种病原在蜂群内的动态变化情况。结果显示:CSBV蜂群感染率在春季3月最高,为84%,到夏季7月降到最低,又从秋季开始升高,一直延续到冬季;蜂房球菌感染率从春季开始升高,到夏季开始下降,又从秋季开始升高,在10月和11月达到全年最高水平,为72%,冬季略有下降;在一年当中,蜂群内中蜂囊状幼虫病和欧洲幼虫腐臭病病原具有共同存在的现象;通过实时荧光定量聚合酶链式反应检测发现,秋季蜂房球菌存在的蜂群内CSBV载量显著高于单一检出CSBV的蜂群(P<0.05)。总之,本研究明确了浙江省淳安县中蜂2种主要病原在蜂群中的全年流行动态情况,可为该地区中蜂病害的预防和控制提供理论指导。

幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为快速鉴别诊断蜜蜂美洲幼虫腐臭病(American foulbrood,AFB)和欧洲幼虫腐臭病(European foulbrood,EFB),本研究根据Gen Bank中登录的幼虫芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)和蜂房蜜蜂球菌(Melissiciccus pluton)16S r RNA基因序列分别设计特异性引物和探针,建立了双重Taq Man荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法与其他病原无交叉反应;对P.larvae和M.pluton的检测灵敏度均达10 copies/μL的阳性质粒;重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于2%。应用该方法对200份实验室模拟样品和200份临床样品进行了检测,与预期结果一致。本研究建立的方法可用于AFB与EFB的快速鉴别诊断和早期监测,以及蜂产品中P.larvae和M.pluton的定量分析。

欧洲幼虫腐臭病病原检测及防控建议

欧洲幼虫腐臭病(European Foulbrood,EFB),是以蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus plutonius)为主要致病菌的一种严重危害蜜蜂健康的细菌性传染病。近年来,山东省多次暴发欧洲幼虫腐臭病,给蜂农造成了巨大的经济损失,但目前尚缺乏快速有效的鉴定手段和预警机制。因此,开展对山东省内欧洲幼虫腐臭病流行现状的调查研究具有重要意义。该研究采用快速准确的PCR分子检测方法,对来自山东省17个地市67家蜂场的134份意大利蜜蜂样品进行蜂房蜜蜂球菌检测。结果显示,在临沂、青岛、烟台、滨州、威海5个地市的6家蜂场检测到蜂房蜜蜂球菌,感染率8.96%。将检测结果及时反馈给蜂农,达到了快速诊断、及时防治的目的,取得了显著效果。该次研究为山东省进一步开展蜜蜂病害防治工作提供了理论依据,为山东省蜂产业的健康发展奠定了基础。

浙江省淳安县中华蜜蜂蜂房球菌聚合酶链式反应检测方法的建立与应用

通过建立蜂房球菌(Melissococcus pluton)的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测方法,对浙江省淳安县主要中华蜜蜂(Apis cerana cerana)饲养区进行欧洲幼虫腐臭病的流行病学调查。结果显示,新建立的蜂房球菌PCR检测方法特异性强,灵敏度高,并具有良好的重复性和准确性。流行病学调查表明,在淳安县17个乡镇的298群蜜蜂样品中,共有11个乡镇检出蜂房球菌,检出率为25.2%,其中5个乡镇的阳性检出率≥40%。总之,本研究建立了一个新的蜂房球菌PCR检测方法,明确了淳安县中华蜜蜂对欧洲幼虫腐臭病的感染情况,为合理制定该病害的防治措施提供了科学依据。

蜜蜂幼虫粪肠球菌的分离与鉴定

在对患有欧洲幼虫腐臭病的蜜蜂幼虫进行细菌分离与培养时,获得1株未知菌株。从分离培养特性、形态学、生理生化特性和分子生物学等方面对该菌株进行了鉴定,得知该菌株为欧洲幼虫腐臭病的次生菌——粪肠球菌,属于肠球菌属,并暂定名为Enterococcus faecalis FB102。同时,得知根据该菌的分离培养特性可与欧洲幼虫腐臭病病原区分,并且将其单独接种蜜蜂幼虫后未能使幼虫患病。根据粪肠球菌较欧洲幼虫腐臭病病原易于分离培养的特性,得知通过对粪肠球菌的鉴定可以简化欧洲幼虫腐臭病的诊断过程,而且推测该菌株可能对人体健康有一定的影响。

蜂蜜中蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的检测方法研究

蜜蜂欧洲幼虫腐臭病是世界上最严重的蜜蜂病害之一,病原体主要是蜂房蜜蜂球菌。我国现有检测标准和文献中关于检测蜂蜜中蜂房蜜蜂球菌的方法很少,本研究是在蜂蜜中检测蜜蜂欧洲幼虫腐臭病,将微生物培养法和PCR法结合,改进了对病原菌的培养和分离,再用PCR法定性鉴别,降低了检出限,提高了检测的准确性。