WD患者ATP7B基因exon8 DNA突变检测方法的研究

目的对肝豆状核变性(又称Wilson病,WD)ATP7B基因的突变热点外显子8进行PCR扩增产物Msp I酶切和电泳分析及DNA直接双向测序,进而对实验中的方法进行优化研究。方法对102例患者和20例健康人提取基因组DNA,PCR扩增ATP7B基因第8号外显子,扩增产物进行Msp I酶切反应,并进行DNA直接双向测序;讨论分析改进PCR扩增、Msp I酶切的方法学,并对测序结果与临床表型做相关性研究。结果102例WD患者,用反复多次改进的实验方法研究分析后,发现35例存在Msp I酶切结果异常并经测序证实,8号外显子Arg778Leu纯合突变占所有WD病人的34.31%,其中1例伴Leu770Leu多态性同义突变;对照组未检出突变。结论改进实验方法后发现PCR扩增良好,适宜测序;WD突变热点8号外显子中Arg778Leu为主要突变形式,PCR-Msp I酶切反应可作为WD病人ATP7B8号外显子Arg778Leu突变的筛选方法,直接双向测序是确定8号外显子突变位点的可靠方法之一。

肝豆状核变性患者ATP7B基因8、12号外显子突变的DNA分析

目的对肝豆状核变性(Wilson disease,WD)ATP7B基因的外显子8、12进行DNA测序分析并建立直接基因诊断方法。方法102例WD患者和82例对照正常人提取基因组DNA,PCR扩增ATP7B第8、12号外显子,8号外显子及12号外显子扩增产物分别行MspⅠ及Tail内切酶酶切分析;后对所有患者及对照组DNA外显子扩增产物行直接测序。结果102例WD患者,8号外显子35例存在MspⅠ酶切反应异常,测序示Arg778Leu纯合或杂合突变(占34.31%),其中12例伴Leu770Leu多态性;12号外显子13例存在Tail酶切反应异常,测序示Thr935Met杂合错义突变(占12.75%),1例存在Arg919Gly杂合错义突变,Arg952Lys在患者及对照组中均检出。结论ATP7B基因外显子8、12为WD突变热点,其中8号外显子以Arg778Leu、12号外显子以Thr935Met为主要突变形式,临床上可用PCR-MspⅠ酶切、PCR-Tail酶切反应作为WD患者初步筛选方法。

用芯片电泳快速检测人p53基因外显子8上的突变点

目的 :建立简单快速的分析方法检测基因突变。方法 :利用修饰引物进行特异性单碱基延伸 ,采用Cy5荧光染色标记的ddNTP ,并通过芯片电泳来检测。结果 :实测了合成人p5 3基因外显子 8上突变点的 3种可能形态 (野生型 ,突变型和杂合型 ) ,并测定了一系列不同比例突变率的混合样本 ,最低至 5 %突变率。所有样本分别于芯片电泳中在 10 0s之内被检测出来。结论 :该方法操作简单易行 ,可用于快速检测已知的基因突变。

版纳微型猪近交系AO血型基因外显子7和外显子8遗传特征分析

猪的UDP-N-乙酰半乳糖胺转移酶(UDP-N-acetylgalactosamine transferase,UDP-Gal NAc)是负责转移一分子的N-乙酰-D-半乳糖胺基(NAc Ga1)到H底物上形成A抗原,从而决定A型血的转移酶,AO血型系统的A基因编码A转移酶。采用PCR技术和直接测序的方法对版纳微型猪近交系UDP-Gal NAc基因外显子7和外显子8进行多态性分析,均仅检测到1种基因型。通过序列比较发现,版纳微型猪近交系UDP-Gal NAc基因外显子7和外显子8与NCBI数据库中14个其他物种的ABO血型基因存在较高的同源性。与人相比,猪外显子7第92~97位缺失编码两个氨基酸的6个碱基。构建的基因进化树分析结果显示版纳微型猪近交系与牛、羊、鲸亲缘关系最近。

大白猪STK32B基因外显子8多态性及其与母猪繁殖性状的关联

【目的】揭示大白猪丝氨酸/苏氨酸激酶32B(serine/threonine kinase 32B,STK32B)基因外显子8多态性及其与母猪繁殖性状的关联。【方法】采用PCR产物直接测序法检测476头大白猪STK32B基因外显子8区域的SNP位点,结合2177窝母猪繁殖性能记录,采用最小二乘模型分析各SNP位点不同基因型及其单倍型组合对5个繁殖性状的影响。【结果】大白猪STK32B基因外显子8区域共检出3个SNP位点,包括2个同义突变位点(A669G、C732T)和1个错义突变位点(C749T),分别以AA、CC、CC基因型和A、C、C等位基因的频率最高,3个位点的多态信息含量(0.1450~0.1744)和杂合度(0.1574~0.1930)总体不高。A669G位点的AA基因型可显著提高仔猪初生窝质量(P<0.05);C732T位点与总产仔数、产活仔数、仔猪初生窝质量显著关联,其中TT基因型可显著提高总产仔数(P<0.05),CT基因型可显著提高产活仔数和仔猪初生窝质量(P<0.05);C749T位点的TT基因型可显著提高仔猪初生窝质量(P<0.05);3个位点单倍型组合ACC/ATC具有极显著提高总产仔数和产活仔数的效应(P<0.01),ACC/ACT组合具有显著或极显著提高仔猪初生窝质量和断奶窝质量的效应(P<0.05或P<0.01),ACC/GCT组合具有显著提高断奶仔猪数的效应(P<0.05)。【结论】研究结果初步揭示大白猪STK32B基因外显子8多态性与母猪繁殖性状显著关联,但3个位点单倍型组合的效应具有一定的性状特异性。

生物发光分析法检测P53基因上的突变点

目的 建立简单、快速和廉价的基因突变测定方法。方法 采用基于生物发光技术的焦测序法测定基因突变 ,并通过毛细管和气压方式循环递加微量脱氧核糖核酸 (dNTP)完成焦测序反应。结果 建立了一种供焦测序反应的新型装置 ;研究了焦测序反应的影响因素和实验条件 ;实测了P5 3外显子 8上Cys2 75Ser突变点的 3种可能形态 (野生型、突变型和杂合型 ) ,并提出了快速判断基因突变类型的方法。结论 建立的方法简单 ,仪器装置成本低、操作简便 。

胃癌组织中p53基因突变及蛋白表达的研究

目的探讨胃癌组织中p53基因第5～8外显子突变率及p53蛋白的表达。方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)和银染技术,对30例胃癌石蜡包埋组织中p53基因第5～8外显子突变率进行检测;同时应用免疫组织化学Envision二步法检测胃癌组织中p53的表达水平。结果30例胃癌石蜡标本中有11例发生p53基因的突变,突变率为36.67%。病理组织学观察胃癌中乳头状腺癌/管状腺癌(分化较好)16例,低分化腺癌/印戒细胞癌(分化较差)14例。p53蛋白随胃癌的分化程度降低而增加,阳性表达率递增(P<0.05)。结论胃癌组织中p53基因突变及p53蛋白高表达在胃癌的发生中有重要的作用及意义。从石蜡包埋组织中提取DNA进行分子生物学检测适用于肿瘤研究。

载脂蛋白H基因多态性与冠心病及血脂代谢关系的研究

目的探讨载脂蛋白H(ApoH)外显子3、8基因多态性与冠心病(CHD)、血脂代谢的关系。方法采用聚合酶链式反应-单链构象多态技术(PCR-SSCP)分析方法,分析了100例健康人及110例CHD患者的ApoH外显子3,8基因型及血脂测定。结果(1)CHD组外显3 GG基因型的频率为81.8%,GA+AA基因型频率为18.2%,G等位基因频率为88%,A等位基因频率是12%,与对照组比较无差异。(2)CHD组外显子8 GG基因型频率为74.5%,GC基因型频率为25.5%,G等位基因频率为87%,C等位基因频率为13%,与对照组比较CHD组的GC基因型频率及C等位基因频率显著增高。(3)外显子3 CHD组低密度胆固醇(LDL-C)高于对照组(P<0.05),CHD组及对照组各基因型间的血脂水平无差异;(4)外显子8 CHD组LDL-C也显著高于对照组(P<0.05),CHD组GC基因型的甘油三酯(TG)显著高于GG型和及对照组的各基因型。结论(1)ApoH外显子3基因多态性与CHD及血脂代谢无相关性;(2)ApoH外显子8 GC基因型及C等位基因与CHD有关,ApoH外显子8基因多态性与TG有关。

载脂蛋白H基因多态性与冠心病关系的研究

目的探讨载脂蛋白H(ApoH)外显子3、8基因多态性与冠心病(CHD)的关系。方法采用聚合酶链式反应结合限制性片段长度多态分析方法,分析了100例健康人及110例冠心病患者的ApoH外显子3、8基因型。结果CHD组外显3GG基因型的频率为81.8%,GA+AA基因型频率为11.8%,G等位基因频率为88%,A等位基因频率是12%,与对照组比较无差异,CHD组外显子8GG基因型频率为74.5%、GC基因型频率为25.5%,G等位基因频率为87%,C等位基因频率为13%,与对照组比较CHD组的GC基因型频率及C等位基因频率显著增高。结论ApoH外显子3基因多态性与CHD无相关性;8GC基因型及C等位基因与CHD有关。

肝豆状核变性基因突变的生物信息学分析

目的:分析预测肝豆状核变性(WD)基因突变与蛋白结构、功能改变的关系,为WD的早期基因诊断与治疗提供参考。方法:选取符合Wilson病诊断标准的患者6例及健康对照者6名作为研究对象,用盐析法抽提受试者基因组DNA并进行测序鉴定,检测受试者WD基因突变情况;通过生物信息学分析手段分析预测WD基因的生物学特性及理化性质,对WD基因编码蛋白及发生基因突变的外显子进行同源模建,分析基因突变与其空间构象变化的关系。结果:6例患者中有3例为第8外显子突变(2例为Arg778Leu,1例为Arg778Gln),有2例为第12外显子突变(Thr935Met和Arg919Gly),1例为第7外显子突变(Trp650Ser);蛋白生物信息学分析发现,蛋白总体带负电荷,不稳定指数45.26,蛋白分子量为157.23k Da,蛋白具有两亲性分子的特点;蛋白有8个跨膜区,二级结构主要有α-螺旋,无规则卷曲,延伸结构及β-转角;同源模建结果显示,778位氨基酸的突变导致外显子8的空间构象发生明显改变;而外显子12的935和919位氨基酸突变则对其空间构象影响不大。结论:778位氨基酸突变或许不是一个温和突变,该位点的突变对本病的发生影响更为深刻。

杜撒♂×大长撒♀F_(1)代猪ARHGEF37基因多态性及其对生长性状的影响

【目的】揭示ARHGEF37基因多态性及其对猪生长性状的影响,为利用该基因标记推进滇撒猪配套系的进一步选育及开发利用提供参考依据。【方法】以274头杜撒♂×大长撒♀F;代猪为试验材料,采用PCR扩增产物直接测序法检测ARHGEF37基因外显子8多态性,采用最小二乘模型分析各SNP位点基因型及单倍型组合对5个生长性状的影响。【结果】在杜撒♂×大长撒♀F;代猪ARHGEF37基因外显子8上检测出C1262G、T1293C、G1395A和C1398T 4个SNPs位点,分别以CC、TT、GA、CC基因型、等位基因C、T、G、C及单倍型CTGC的频率最高;除T1293C位点外,其余各位点的杂合度在0.4552~0.4940,遗传多样性较丰富。C1262G位点GG基因型个体达100 kg体重日龄(258.93±2.95 d)显著高于CG基因型个体(249.87±2.68 d)(P<0.05,下同),CG基因型个体30~60 kg日增重(462.44±15.44 g)显著高于CC基因型个体(409.29±14.30 g);T1293C位点TT基因型个体30~60 kg日增重(445.04±9.70 g)极显著高于TC基因型个体(329.33±42.26 g)(P<0.01),TT基因型个体30~100 kg日增重(516.96±6.44 g)显著高于TC基因型和CC基因型个体(470.92±28.08 g和480.64±16.94 g)。此外,达60 kg体重日龄和达100 kg体重日龄均以CTGC/GTGC组合最短(161.84±5.07 d和241.00±5.11 d),CTGC/CCGC组合最长(188.80±11.33 d和272.60±11.42 d);30~60 kg日增重和30~100 kg日增重分别以CTGC/GTAT组合和CTGC/GTGC组合最高(479.56±20.66 g和545.42±19.76 g),均以CTAC/CCGC组合最低(275.00±84.33 g和437.00±55.88 g)。【结论】ARHGEF37基因的G1395A和C1398T位点的遗传多样性较丰富;C1262G位点的CG基因型、T1293C位点的TT基因型及CTGC/GTGC单倍型组合对杜撒♂×大长撒♀F;代生长性状的影响较大,携带有CTGC单倍型个体的各生长性状均处于较高水平。

江苏徐州地区肝豆状核变性患者ATP7B基因12、14、18号外显子的检测和分析

目的研究江苏徐州地区肝豆状核变性(又称Wilson'病,WD)患者ATP基因12、14、18外显子突变情况,以期建立徐州地区WD的ATP基因突变热点的检测平台。方法采集45例WD患者及50例正常人外周血,提取基因组DNA,PCR扩增ATP7B第12、14、18号外显子,12号外显子扩增产物进行Tail内切酶酶切分析;然后对所有病人及正常人DNA外显子扩增产物进行直接测序,进而与临床表型做相关分析。结果 45例WD病人中,共发现6例突变。12号显子无1例存在Tail酶切反应异常,测序共发现2855G→A多态(即Arg952Lys)9例,其中1例合并12号外显子2828G→A杂合突变(即Gly943Asp),18号外显子发现3884C→T(即Ala1295Val)杂合突变5例,其中2例合并3889G→A多态(即Val1297lle),14号外显子未见突变。结论 18号外显子可能是徐州地区WD患者的基因突变热区,可作为徐州地区WD可疑患者的优先筛选区域之一。12、14号外显子可能不是徐州地区WD患者的基因突变热区。

中国人肝豆状核变性ATP7B基因8号外显子突变研究

目的分析肝豆状核变性(WD)ATP7B基因8号外显子在中国人中的突变特点。方法提取141个无血缘关系家系的146例中国人WD患者和50例健康对照者的外周血DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增ATP7B基因8号外显子,并对产物进行直接测序。应用Sequencing AnalysisTM软件分析测序结果。结果146例WD患者中共发现93例存在基因突变,c.2333G>T(Arg778Leu)错义突变频率为40.78%,包括26例纯合突变,63例杂合突变,且均伴c.2250C>G(Leu770Leu)多态;1例c.2294A>G(Asp765Gly)错义突变发生频率为0.35%;5例c.2298_2299insC(Pro767Pro)插入突变发生频率为1.77%,其中2例并c.2333G>T(Arg778Leu)杂合突变。50例健康对照者均未发现突变。结论在146例中国人WD病患者中,除Arg778Leu热点突变和c.2294A>G错义突变外,c.2298_2299insC为中国患者中未曾报道的新型插入突变。

江苏徐州地区肝豆状核变性患者ATP7B基因8、13号外显子突变的检测和分析

目的研究徐州地区肝豆状核变性(Hepatolenticular degeneration,HLD)患者ATP7B基因8、13外显子突变情况,为本病的早期和产前诊断提供理论依据。方法采集33例HLD患者和30例对照组正常人外周血、提取DNA、PCR扩增ATP7B基因8和13外显子;对扩增产物分别进行限制性内切酶MspI及BtgI酶切分析,反应异常者行DNA测序,最后将突变结果与临床表型作相关性分析。结果 33例HLD患者中,15例存在MspI酶切异常,测序为Arg778Leu杂合或纯合突变,占45.45%(15/33);9例存在BtgI酶切异常,测序为Pro992Leu杂合突变,占27.27%(9/33)。30例正常对照组未检测出突变。结论 ATP7B基因第8、13外显子是徐州地区HLD患者的基因突变热区,筛选本地区HLD可疑患者时应优先检测。

准噶尔双峰驼DGAT1基因外显子8序列生物信息学分析

为了研究准噶尔双峰驼二酰基甘油酰基转移酶1(diacylgycerol acyltransferase 1,DGAT1)基因外显子8编码区的理化性质与结构,以及为寻找与双峰驼泌乳性状相关的分子遗传标记提供基础资料,试验对准噶尔双峰驼DGAT1基因外显子8进行PCR扩增,利用生物信息学方法对DGAT1蛋白结构、理化性质及信号肽、跨膜位置等进行分析,并比较了准噶尔双峰驼与其他物种DGAT1氨基酸序列的进化关系。结果表明:准噶尔双峰驼DGAT1基因外显子8扩增产物大小为421 bp,编码484个氨基酸,有1个保守域,位于62~468位氨基酸处。DGAT1蛋白属于亲水性蛋白,且为不稳定的非经典分泌蛋白。二级结构中,α-螺旋占48.35%,延伸链占14.46%,β-转角占4.13%,无规则卷曲占33.06%,存在9个蛋白跨膜结构区域。骆驼科的双峰驼、单峰驼和野骆驼的DGAT1蛋白独立成支,与牛DGAT1蛋白的分子进化距离相距较远。准噶尔双峰驼DGAT1基因外显子8序列及蛋白质结构与牛DGAT1蛋白卷曲方式、立体空间结构方面基本一致。说明DGAT1基因在物种间变异不大。

Ph染色体阴性骨髓增殖性肿瘤患者JA砬基因第12外显子突变研究

目的探讨Ph染色体阴性骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者JAK2基因第12外显子（JAK2exon12）突变情况及其与临床特征的关系。方法采用等位基因特异性聚合酶链反应（AS—PCR）检测573例Ph染色体阴性MPN患者．IAK2V617F突变，直接测序法检测JAK2exon12突变状态，克隆后测序鉴定突变类型。比较JAK2eXOB12突变与JAK2V617F患者的临床和实验室特征，并研究该突变与表观遗传调节子基因突变及JAK246／1单倍型的关系。结果在原发性血小板增多症（ET）、原发性骨髓纤维化（PMF）、骨髓增殖性肿瘤未分类型（MPN—U）及JAK2V617F阳性真性红细胞增多症（PV）患者中均未发现JAK2exon12突变，在13例JAK2V617F阴性PV患者中发现2例（15．4％）存在该基因突变，均为N542-E543del，即第542位天冬酰胺和第543位谷氨酸缺失。2例JAK2exon12突变的患者以红细胞增多为主要表现，白细胞及血小板计数增高不明显，骨髓以红系增生为主，血清促红细胞生成素（EPO）水平低于正常，造血干／祖细胞体外培养可检测到内源性红系集落（EEC），不伴有表观遗传调节子基因TET2、ASXL1、EZH2突变，其中1例患者46／1单倍型rsl2340895和rsl0974944位点均为CC基因型，另1例患者上述两个位点均为GC基因型。结论JAK2V617F阴性的ET、PMF、MPN—U患者无需再行JAK2exon12突变检测；JAK2exon12突变的PV患者具有特定的临床和实验室特征。

rs25754G/A多态性与颈动脉斑块稳定性的关系

为了探讨一种具有玉型血小板反应蛋白的去整合素和金属蛋白酶12 (ADAMTS-12)基因rs25754G/A单核苷酸多态性(SNPs)与颈动脉斑块稳定性的关系,本研究选择78例颈动脉易损斑块患者和101例颈动脉稳定斑块患者作为本次实验的受试对象,应用荧光标记-限制性内切酶酶切法对ADAMTS-12基因rs25754G/A位点进行SNPs基因型检测,运用SPSS16.0统计学软件进行等位基因和基因型频数分布的分析。研究结果显示,颈动脉易损斑块组ADAMTS-12基因rs25754G/A多态位点G+AA基因型和A等位基因频率(98.72%和87.82%)明显高于颈动脉稳定斑块组(90.10%和62.38%)(p<0.05)。本研究初步结论表明,ADAMTS-12基因rs25754G/A多态位点与颈动脉易损斑块的发生有相关性。