人工合成RGD小肽对肝星状细胞分泌细胞外基质的影响

目的 :探讨精氨酰甘氨酰天冬氨酸肽 (Arg -Gly -Asp ,RGD)对肝星状细胞分泌细胞外基质 (extra cellularmatrix ,ECM)的影响。方法 :利用化学方法合成RGD ;应用胶原酶原位灌注法分离SD大鼠原代肝星状细胞 (hepaticstallatecell,HSC) ,接种培养 4 8h后 ,随机分成 4组 :①空白对照组 ;②转化生长因子 β1(transform inggrowthfactorβ1,TGFβ1)组 :只加TGFβ1(终浓度 5ng/ml) ;③RGD组 :只加RGD(终浓度 10 0 μg/ml) ;④联合加药组 :加RGD(终浓度 10 0 μg/ml)同时加TGFβ1(终浓度 5ng/ml)。连续培养 3d后 ,放射免疫分析细胞上清液各项ECM含量变化。结果 :与空白对照组相比 ,TGF β1组和联合加药组细胞上清液中透明质酸(hyaluronicacid ,HA)、层粘连蛋白 (laminin ,LN)和Ⅲ型前胶原 (procollagenⅢ ,PCⅢ )水平均显著增高 ,RGD组细胞上清中各项ECM水平则无明显改变 ;与TGFβ1组相比 ,联合用药组HSC细胞上清LN和PCⅢ水平明显降低。结论 :RGD明显降低HSC培养上清中LN和PCⅢ含量 ,表明RGD能抑制原代HSC合成及分泌ECM ,其机制可能与竞争性结合整合素有关。

大鼠系膜细胞醛固酮的合成及其对细胞外基质生成的影响

目的 证明肾脏系膜细胞能够自身合成醛固酮 ,并探讨醛固酮对系膜细胞细胞外基质生成的影响。方法 用RT PCR法检测大鼠系膜细胞醛固酮合成酶CYP11B2mRNA表达 ,PCR产物存化后直接测序 ;放免法测定系膜细胞培养上清液中醛固酮的浓度。用RT PCR半定量法比较 (3 磷酸甘油醛脱氢酶theenzymeglyceraldehyde 3 phosphatedehydrogenase ,GAPDH为内参照 )经 10 -10 ～ 10 -6mol/LAngⅡ或 7mmol/L、9mmol/LKCl干预 4 8h ,系膜细胞CYP11B2mRNA的表达量。大鼠系膜细胞醛固酮特异性受体 (mineralocorticoidreceptor,MR)和保护其配体特异性的 11β -羟类固醇脱氢酶 2 (11β -HSD2 )的mRNA和蛋白质表达分别用RT PCR法和细胞免疫化学法检测。以ELISA和Western印迹方法检测经 10 -7mol/L醛固酮干预 2 4h ,细胞培养上清液中层黏蛋白 (FN)和Ⅳ型胶原的浓度。结果 大鼠系膜细胞能表达CYP11B2mRNA ,且细胞培养上清液中检测到醛固酮 ,浓度为 1 0 6 5pg/ 10 6个细胞。 10 -8、10 -7mol/LAngⅡ (10 -8mol/L :2 15± 0 10 ,10 -7mol/L :1 16± 0 0 4vs非干预组 0 77± 0 0 3,P <0 0 0 1;)和 9mmol/L的KCl (1 2 7± 0 11vs非干预组 0 89± 0 12 ,P <0 0 5 )均能显著提高CYP11B2mRNA的表达。大鼠系膜细胞有MR和 11β

醛固酮可通过钠氢交换子1诱导肾小球系膜细胞外基质增生

目的探讨醛固酮能否在肾小球系膜细胞(GMC)激活钠氢交换子1(NHE1),以及能否通过NHE1诱导GMC细胞外基质增生。方法体外培养大鼠GMC,并按如下分组:对照组(Con,普通培养液);醛固酮组(Aldo,10-7mol／L);醛固酮+安体舒通组(Aldo+Spir 10-9 mol／L);醛固酮+NHE1抑制剂DMA组(Aldo+DMA 25μmol／L)。24 h后收集培养上清液和各组细胞,抽提总RNA。用酸负荷后钠依赖的pHi(细胞内pH值)的变化来检测NHE1活性,同时采用实时PCR以及流式细胞术检测NHE1基因和蛋白的表达。采用实时PCR和ELISA方法检测纤连蛋白(FN)基因和蛋白的表达。结果与对照组比较,Aldo组肾小球系膜细胞NHE1的活性(△pHi／100S)显著增高[Con(4．48±0．25)％,Aldo(5．29±0．11)％,P<0．05]。加入安体舒通和DMA后,上述NHE1活性均有所降低[Aldo+Spir(4．92±0．35)％,Aldo+DMA(4．07±0．23)％,与Aldo组比较,P<0．05]。实时PCR结果显示Aldo组NHE1 mRNA水平有所增高,是对照组的1．16倍(P<0．05),而Aldo+Spir组NHE1 mRNA水平明显下降,是Aldo组的81．9％(P<0．05)。流式细胞术结果显示Aldo组NHE1蛋白水平显著增高,是对照组的2．9倍(P<0．01),而Aldo+Spir组NHE1蛋白水平明显下降,仅为Aldo组的52．3％(P<0．05),安体舒通本身对NHE1的基因和蛋白表达没有显著影响。实时PCR结果显示Aldo组FN mRNA水平有所增高,是对照组的1．03倍(P<0．05); Aldo+Spir组和Aldo+DMA组FN mRNA水平有所下降,分别是Aldo组的91．21％(P<0．01)和92．30％(P<0．01)。ELISA结果显示培养上清液中分泌的FN(ng／ml)也表现为相同的趋势[Con(17．84±3．77),Aldo(51．66±1．40),P<0．01;Aldo+Spir(29．60±1．99),Aldo+DMA(25．75±4．66),与Aldo组比较,P<0．01]。结论醛固酮能够刺激肾小球系膜细胞分泌细胞外基质成分FN,其作用可能是由于醛固酮激活系膜细胞NHE1活性、上调其基因和蛋白表达所致。