低强度次声对体外培养的骨样细胞骨架蛋白F-actin表达的动态影响

目的:探讨4Hz/100dB、12Hz/100dB、20Hz/100dB的次声作用后,小鼠成骨样细胞MC3T3的细胞骨架F-actin表达的改变。方法:将MC3T3接种于细胞玻片上,并分为对照组和4Hz/100dB、12Hz/100dB、20Hz/100dB的次声暴露组。对照组无次声输出,其他各组接受次声作用30min/d。第3d于暴露后2h、4h、8h不同时间,对细胞进行F-actin的免疫荧光染色,应用激光扫描共聚焦显微镜,观察细胞F-actin的表达改变,测定单个细胞F-actin的平均荧光强度。结果:对照组细胞大部分荧光物质呈弥漫状态,胞膜荧光较强,胞浆内少量肌动蛋白纤维丝,方向不规则,长短不一;不同频率次声作用后2h,各次声作用组均可看到胞浆中微丝F-actin明显粗大纤长,荧光物质大多为较长的粗大应力丝,沿细胞纵轴排列较多,其中20Hz/100dB组的荧光强度增强较对照组具有显著意义(P<0.05);在次声作用后4h和8h,次声作用组的细胞F-actin仍处于较高表达状态,其中12Hz/100dB组和20Hz/100dB组的荧光强度增高较对照组具有显著意义(P<0.05)。不同频率次声作用组细胞的F-actin变化趋势较一致,各组在各时间点未见明显差异(P>0.05)。结论:4Hz、12Hz和20Hz的100dB的次声作用30min/d后,可诱导F-actin表达的增强,这种改变在8h后仍未见减弱。

NUAK1通过影响F-actin聚合促进乳腺癌的侵袭转移

本课题组先前研究证明NUAK1/ARK5参与乳腺癌、胶质瘤侵袭转移,但机制尚不清楚.本文证明,NUAK1通过影响F-actin聚合促进乳腺癌的侵袭转移.应用小RNA干扰技术敲除乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的NUAK1,用G418进行稳定筛选,并用Western印迹进行蛋白质表达检测,结果显示,成功敲除MDA-MB-231细胞中的NUAK1;采用Transwell侵袭实验检测NUAK1在乳腺癌细胞侵袭转移中的作用,结果表明,NUAK1被干扰的SiNUAK1/MDA-231细胞的侵袭能力明显减弱;应用免疫荧光法对细胞的F-actin进行荧光染色,半定量F-actin聚合分析结果显示,IGF-1在转染空载的细胞组(Scr/MDA-231)能诱导肌动蛋白短暂的聚合反应,而在敲除NUAK1的细胞组(SiNUAK1/MDA-231)肌动蛋白的聚合显著减少;用细胞因子IGF-1刺激乳腺癌细胞观察cofilin磷酸化,结果显示,在敲除NUAK1的细胞组(SiNUAK1/MDA-231),IGF-1诱导的cofilin的磷酸化明显受抑制.上述结果表明,NUAK1能通过促进F-actin的聚合从而影响乳腺癌细胞的侵袭转移.

TGF-β1通过F-actin聚合促进乳腺癌细胞MCF-7发生上皮-间质转化

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是上皮细胞失去极性,获得间质形态的一个过程.肿瘤细胞中,EMT的激活促进了肿瘤的侵袭转移.转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-1）属于TGF家族,它能够调节细胞增殖、分化、细胞凋亡及细胞外基质的生成等.

切应力条件下与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞整合素β_1和F-actin的变化

目的 探讨与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞力学信号转导的机制 ,研究切应力对联合培养的内皮细胞表面整合素 β1和F actin的影响。方法 应用免疫荧光双重标记、激光共聚焦扫描显微镜和计算机图象分析等技术 ,观察了在 2Pa层流切应力的作用下 ,与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞表面整合素 β1的含量及细胞骨架F actin的变化 ,时相点分别取 1h、6h、12h和 2 4h。同时 ,以静态条件下联合培养的内皮细胞为对照组。结果 静态条件下联合培养的内皮细胞表面整合素 β1含量少 ,F actin含量亦少 ;在 2Pa层流切应力的作用下 ,随着时间延长 ,整合素 β1表达逐渐增多 ,并且有沿F actin分布的趋势 ,在 12h达到峰值 ,后又下降 ;F actin含量持续增加直至 2 4h。结论 结果提示整合素 β1作为重要的粘附分子 ,与细胞骨架F actin的相互协作 。

阿魏酸对兔受损窦房结细胞骨架F-actin、Vinculin的影响

目的观察阿魏酸对模拟缺血再灌注损伤兔窦房结细胞骨架蛋白F-actin和Vinculin的影响,探讨其保护窦房结细胞的机制。方法取新生乳兔窦房结细胞,以缺氧缺糖模拟缺血,以恢复氧和糖的供应模拟再灌注造成窦房结细胞损伤模型。正常对照组与模型组给予等体积培养基,阿魏酸高、中、低剂量组分别给予相应浓度药物(终浓度分别为100μmol/ml、20μmol/ml、10μmol/ml),运用酶标仪、激光共聚焦显微镜观察各组窦房结细胞活性、细胞骨架蛋白F-actin和Vinculin形态的变化。结果模型组活细胞量较正常对照组明显减少(P<0.01);细胞骨架蛋白F-actin和Vinculin裂解明显。阿魏酸高、中、低剂量组活细胞量明显高于模型组(P<0.01),F-actin和Vinculin结构较模型组明显完整,平均荧光强度明显高于模型组(P<0.01)。结论阿魏酸可抑制模拟缺血再灌注引起的窦房结细胞损伤;阿魏酸保护窦房结细胞的机制可能与保护细胞骨架蛋白F-actin和Vinculin从而维持细胞电生理稳定有关。

Nelin与F-actin及Filamin相互作用的鉴定

目的在用酵母双杂交方法将Nelin与人心脏cDNA文库进行杂交筛选,得到3个阳性克隆的基础上,进一步探讨新基因Nelin及其心肌表达产物Nelin蛋白的功能,并寻找能够与其发生相互作用的蛋白质。方法采用基因转染和表达技术,在真核细胞内外分别进行了Nelin蛋白与肌动蛋白(F-actin)结合的共沉降及免疫荧光共定位实验。并通过免疫共沉淀实验进一步验证所得的实验结果。结果证实了在细胞内外Nelin蛋白均能同F-actin相结合;还能与Filamin的C-末端免疫球蛋白样结构发生相互作用。结论Nelin为一个新的兼有actin及Filamin结合能力的蛋白。在心肌细胞内,Nelin很可能作为一个膜-细胞骨架连接蛋白,参与了细胞黏着斑形成的过程。

细胞内F-actin的聚合与解聚对肝癌Bel-7402细胞的影响

目的 :为探讨癌细胞内F actin的解聚与聚合对癌细胞的形态、迁移、侵入的影响。方法 :利用激光共聚焦显微镜对贴附培养的人肝癌Bel 74 0 2细胞形态及其细胞内F actin进行观察 ;使用流式细胞仪对贴附的Bel 74 0 2细胞及其脱落细胞与Cyt B处理后Bel 74 0 2细胞内F actin的含量进行分析。结果 :Bel 74 0 2细胞在培养的过程中 ,癌细胞形态伸展 ,出现侵入性生长 ,细胞内F actin聚合形成粗大的贯通细胞内的F actin束 ,F actin含量增高 ;癌细胞在生长过程中 ,常出现重叠生长 ,细胞变圆 ,F actin解聚变短 ,F actin小体增高 ,细胞有脱落的趋势 ,其脱落细胞内的F actin含量低于贴附细胞。结论 :人肝癌Bel 74 0 2细胞内F actin的聚合可增加癌细胞的贴附和侵入性 ;细胞内F actin的解聚 ,及G actin重新聚合形成F

CD2AP突变对肾小球足细胞骨架蛋白F-actin分布的影响

目的构建突变型CD2相关蛋白(CD2AP)荧光表达载体并转染肾小球足细胞,观察细胞内骨架蛋白F-actin分布的变化。方法定点诱变真核表达质粒pcDNA6-V5-CD2AP致CD2AP第2外显子160G>A杂合突变,测序鉴定。利用野生型和突变型质粒和pEGFP-C1荧光表达载体,分别构建野生型和突变型重组质粒pEGFP-C1-CD2AP荧光表达载体并转染小鼠肾小球足细胞,荧光显微镜观察处于不同细胞周期的足细胞内F-actin分布情况。结果测序结果显示,pcDNA6-V5-CD2AP真核表达载体CD2AP的2号外显子第160位碱基G诱变为A,而其他碱基未发生改变。在细胞分裂间期,未转染足细胞内F-actin平行排列成纤维束;野生型重组质粒转染足细胞内F-actin在细胞核周围呈点、块状浓聚;而突变型重组质粒转染足细胞内F-actin主要在细胞膜上勾出轮廓。在细胞分裂中期,野生型重组质粒转染足细胞内F-acin纤维丝呈粗纤维状,环细胞浓聚;突变型重组质粒转染足细胞则仅见胞质内F-acin纤维丝增多,部分区域浓聚。结论成功构建野生型和突变型重组CD2AP荧光表达载体。CD2AP基因160G>A杂合突变使肾小球足细胞分裂间期和分裂中期的F-actin纤维骨架发生改变。

肾小球系膜细胞在高糖、胰岛素作用下F-actin的变化

目的 :探讨高糖、胰岛素对肾小球系膜细胞骨架蛋白F -actin的影响 ,进一步探讨F -actin在糖尿病肾病发生发展中的作用。方法 :将培养的鼠 10 97系膜细胞分为 8组 :正常对照组 ,生理浓度胰岛素组 (10 -9M) ,低浓度胰岛素组 (10 -8M) ,高浓度胰岛素组 (10 -6M) ,高糖组 (30mM) ,甘露醇组 ,高糖加高浓度胰岛素组 ,高糖加生理浓度胰岛素组。采用rhodamine-phalloidin染色 ,激光共聚焦显微镜观察F -actin形态并测定荧光强度。结果 :高糖组F -actin荧光强度为对照组的 4 4 5 % ;10 -8M胰岛素组、 10 -6M胰岛素组分别为对照组的 12 2 4 %(P <0 0 5 )和 12 9 6 % (P <0 0 1) ;高糖加 10 -6M胰岛素组为高糖组的 183 8% (P <0 0 5 )。结论 :(1)高糖可促进F -actin解聚 ,胰岛素有一定拮抗作用 ,且呈剂量依赖性。 (2 )F -actin是糖尿病肾病发生发展中的重要因子。

电离辐射对血管内皮细胞骨架蛋白F-actin影响的激光共聚焦显微镜观察

目的:观察电离辐射对血管内皮细胞骨架蛋白F-actin影响,探讨血管内皮细胞电离辐射损伤的机理。方法:用Co60γ射线对体外培养的血管内皮细胞进行0、2、4、6、8、101、2 Gy照射,于照射后6小时后用激光共聚焦显微镜对其细胞骨架蛋白F-actin进行观察。结果:细胞骨架蛋白F-actin随着辐射剂量的增加而解聚增加,这种变化呈剂量依赖性。结论:电离辐射对血管内皮细胞骨架蛋白F-actin的破坏可能是血管内皮细胞辐射损伤机体机理之一。

缺血再灌注损伤对新生鼠肾小管上皮细胞F-actin的影响

目的 研究缺血再灌注不同时段纤维型肌动蛋白(F-actin)在肾小管上皮细胞中分布变化情况,探讨F-actin在肾脏缺血再灌注损伤中所起的作用。方法 建立新生大鼠不同时段的肾脏缺血再灌注模型,通过免疫荧光法检测F-actin在肾小管上皮细胞上的分布,并计算各组F-actin的表达量。结果 正常时,F-actin主要聚集在上皮细胞基底膜处;缺血0.5 h后,细胞浆内的F-actin开始增加;再灌注0.5 h后,大量F-actin开始向胞浆内转移,基底部的表达减少;再灌注2 h后,F-actin在胞浆中仍很多,但在基底部的表达开始增加。结论 缺血再灌注损伤时F-actin的分布从基底部移行到胞浆内,可能由此导致整合素和Na+-K+-ATP酶分布的去极化,引起上皮细胞的脱落和对钠离子重吸收的障碍。

优化大鼠肺动脉平滑肌细胞骨架F-actin图像的激光共聚焦显微技术

目的:优化大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)骨架蛋白F-actin图像的激光共聚焦显微技术。方法:采用不同浓度梯度的荧光染料及不同孵育条件,应用激光共聚焦显微扫描技术对PASMCs细胞骨架F-actin进行形态学观察。结果:终浓度10 mg/mL FITC-鬼笔环肽及10 mg/mL PI,分别染色30 min,并经RNA酶37℃处理为最适实验条件,可见F-actin呈明亮细丝状绿色荧光,PI标记的胞核呈红色荧光,胞浆无明显PI染色。结论:通过对染色条件的最终优化,表现出激光共聚焦技术在平面及三维同时观察细胞骨架F-actin的优越性,为进一步实验提供良好的技术平台。

阿魏酸对兔主动脉血管平滑肌细胞骨架F-actin的作用

目的:观察阿魏酸对兔血管平滑肌细胞骨架F-actin的作用。方法:兔血管平滑肌细胞用含20%灭活胎牛血清的高糖DMEM培养,在阿魏酸作用24h后,用鬼笔环肽标记细胞骨架蛋白F-actin后,用流式细胞仪检测荧光强度,用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架蛋白的变化。结果:阿魏酸作用24h后,流式细胞检测结果显示,细胞骨架蛋白F-actin荧光强度明显减弱,与对照组比较,有显著性差异。激光共聚焦显微镜观察可见细胞形态明显变长,荧光减弱,与对照组比较,荧光密度减弱。结论:阿魏酸对兔血管平滑肌骨架蛋白F-actin的形成有抑制作用。

增强UV-B辐射对小麦叶肉细胞核内F-actin的影响

以增强紫外线B(UV-B)处理的小麦幼苗叶肉细胞核为材料,以异硫氰酸荧光素标记鬼笔环肽(FITC-Ph)荧光标记后,利用流式细胞仪以及激光共聚焦显微镜,对核内肌动蛋白丝(F-actin)进行研究。结果表明:小麦细胞核内确实存在F-actin;以FITC-Ph标记后用流式细胞仪检测显示,以10.08kJ·m-2·d-1增强的UV-B处理后的小麦叶片细胞核内F-actin的含量升高;激光共聚焦技术显示细胞核内Factin的分布,发现小麦叶肉细胞核核仁处F-actin含量较高。推测可能是增强UV-B辐射导致细胞质内Factin骨架断裂进入细胞核。究其具体作用还待进一步研究,该研究推测其与"分束分裂"有关。

宿主细胞F-actin聚集在顶复门原虫入侵过程中的作用研究

病原入侵宿主细胞,由宿主细胞肌动蛋白(F-actin)聚集引起的细胞骨架重排起着极其重要的作用,本文主要就宿主细胞整合素介导的宿主细胞F-actin聚集重排在顶复门原虫入侵过程中的作用进行系统的阐述,对解析顶复门原虫的入侵机制及以此研制新型寄生虫病药物和疫苗具有非常重要的意义。

不同声强超声波对细胞骨架微丝F-actin表达的影响

目的:研究不同声强超声波对人脐血管内皮细胞(ECV-304)细胞骨架F-actin表达的影响,探讨超声波对人体的作用机制。方法:将人脐血管内皮细胞ECV-304接种于6孔板中,分别以频率800kHz,占空比为30%功率密度0.20、0.40、0.60和0.80W/cm2,的脉冲超声波辐射5min,于辐射后不同时间,对ECV-304细胞进行F-actin免疫荧光染色,应用激光扫描共聚焦显微镜,观察细胞F-actin表达的改变,测定单个细胞F-actin的平均荧光强度。结果:假辐射组细胞有中等量的F-actin表达,荧光物质部分呈弥漫状态,部分呈线形应力丝状态,细胞膜荧光较强,胞浆内的肌动蛋白纤维丝,方向不规则,长短不一。四组不同强度超声波辐射后的细胞变化较为一致,辐射后均可看到胞浆中微丝F-actin粗大纤长,弥漫状态的荧光物质相对较少,应力丝沿细胞纵轴排列较多,数量及荧光强度也明显增加,细胞膜荧光较强,超声波辐射的四组细胞之间没有明显的差别。随时间的延长细胞应力丝逐渐减少,12h时已接近正常组细胞,各组细胞的变化是同步的。结论:800kHz的脉冲式超声波辐射ECV-304细胞可诱导F-actin表达的改变,导致细胞骨架重建,超声波强度≤0.80W/cm2时,引起的细胞骨架改变是可逆的。

SHEE细胞形态与细胞内F-actin含量的关系

为了研究食管永生化细胞在不同的培养基中,培养后细胞形态的改变。实验利用显微镜观察,鬼笔环肽(phalloidin)-FITC标记和流式细胞仪技术分析转换培养基与未转换培养基的SHEE细胞。结果显示:转换培养基后,SHEE细胞膜边缘异常,细胞连接松散;细胞内F-actin含量降低。说明细胞培养过程中,更换细胞生长环境可影响到细胞骨架,进而改变细胞形态及细胞的粘附能力。

组织中肥大细胞内F-actin对其不同亚型细胞分泌作用的影响

目的：研究细胞内丝状肌动蛋白的变化对不同亚型肥大细胞分泌作用的影响。方法：利用肥大细胞的特征性蛋白酶抗体和鬼比环肽的免疫荧光标记；以流式细胞仪检测分选人皮肤组织中肥大细胞的亚型；使用激光扫描共聚焦显微镜显示肥大细胞内分泌颗粒和微丝的分布。结果：类胰蛋白酶免疫反应性的肥大细胞内含有丰富的丝状肌动蛋白环，在质膜内层区域形成阻碍类胰蛋白酶释放的屏障；大量的类胰蛋白酶暂存于分泌泡中，少量的类胰蛋白酶因细胞内丝状肌动蛋白环的解聚使之从分泌泡中释放。而类胰蛋白酶和类糜蛋白酶免疫反应性的肥大细胞及类糜蛋白酶免疫反应性的肥大细胞内少见或未见明显的阻碍蛋白酶释放的丝状肌动蛋白环；细胞形态膨胀，细胞内蛋白酶已释放。结论：人皮肤组织中肥大细胞内类胰蛋白酶和／或类糜蛋白酶的含量及其肥大细胞亚型与丝状肌动蛋白环相关联。

神经生长锥内α-spectrin与F-actin的免疫细胞化学研究

目的 为了探讨α 血影蛋白 (α spectrin)和纤维型肌动蛋白 (F actin)在神经生长锥激烈运动与神经生长过程中的作用机制。方法 采用免疫双荧光染色法 ,以共聚焦激光扫描显微镜观察初代培养脊神经节细胞生长锥的连续水平断面上观察α spectrin和F actin的三维分布特点及其相互关系。结果 在水平面上 ,α spectrin和F actin分布在细胞质中 ,尤以细胞膜下、生长锥的P区伸展方向的前端和丝状伪足内分布最多 ,且α spectrin比F actin更接近细胞膜 ;在纵轴方向 ,α spectrin从基质侧到表面游离侧都有分布 ,而F actin在生长锥体部C区和表面游离侧分布较少。结论 提示α spec trin和F actin共同参与生长锥运动、神经生长外 ,还参与构筑生长锥内的三维网架及维持生长锥的极性。

肌纤生成调节因子-1促肌节F-actin组装引起新生乳大鼠心肌细胞肥大

目的探索肌纤生成调节因子-1(myofibrillogenesis regulator-1,MR-1)通过调节肌原纤维生成引起心肌肥大的机制。方法干预MR-1在体外培养的新生乳大鼠心肌细胞中的表达,检测心肌细胞表面积、心房利钠因子和脑钠肽水平及蛋白合成速率3种心肌肥大指标的变化,以鬼笔环肽-异硫氰酸荧光素标志并观察肌节F-actin组装,以半定量反转录-聚合酶链反应、免疫印迹和细胞免疫荧光术检测重要肌节分子myomesin-1、肌球蛋白调节轻链-2(myosin light chain-2,MLC-2)含量及亚细胞定位。结果 MR-1过表达引起心肌细胞肥大、肌节F-actin组装明显促进、MLC-2与myomesin-1表达上调(P<0.05)以及myomesin-1的细胞核-细胞质转位;MR-1沉默后小泛素样调节因子-1过表达引起的转位和肌节F-actin组装明显抑制。结论 MR-1通过促进myomesin-1和MLC-2调节肌原纤维生成引起心肌细胞肥大。