木瓜蛋白酶制备抗人肝癌单抗F（ab’）_2及Fab片段

目的：为了制备肝癌ＭｃＡｂＨＡｂ１８Ｆ（ａｂ’）＿２及Ｆａｂ片段，方法：用激活的木瓜酶分别在偏酸性（ｐＨ５．５）和偏碱性（ｐＨ８．０）条件下消化１８ｈ和１ｈ得到Ｆ（ａｂ’）＿２和Ｆａｂ片段，经ＤＥＡＥ－４０ＨＲ阴离子交换色谱柱在Ｗａｔｅｒｓ６５０Ｅ快速蛋白液相色谱系统（ＥＰＬＣ）上建立其相应的纯化方法。结果：该法制备Ｆ（ａｂ’）＿２得率为４３％～６２％，制备Ｆａｂ得率４２％，其活性用免疫荧光法测定均为１．３６×１０￣（－９）ｍｏｌ／Ｌ。结论：本法操作简单，实用性强，尤其制备Ｆ（ａｂ’）＿２产率及活性均优于胃蛋白酶法。

FPLC纯化单克隆抗体（Fab＇）_2片段

作者采用ＤＥＡＥ－４０ＨＲ阴离子交换色谱柱，在Ｗａｔｅｒｓ６５０Ｅ快速蛋白液相色谱系统（ＦＰＬＣ）建立了抗肝癌单克隆抗体（ＨＡｂ１８）Ｆ（ａｂ＇）２片段的快速纯化方法。该法是将ＭｃＡｂ用胃蛋白酶消化１８ｈ后，上阴离子交换色谱柱纯化，用ｐＨ７．５１０ｍｍｏｌ／ＬＰＢ洗脱，即得到纯化的Ｆ（ａｂ＇）２．一次纯化周期仅需２５ｍｉｎ，一次上样量１２０～１６０ｎｇ蛋白，Ｆ（ａｂ＇）２得率为３４％，回收率为５１％。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定纯度大于９５％，免疫荧光法测定活性为１：４０００．该法操作简单、快速、实用性强，不需要高档次的色谱仪，只要有一台核酸／蛋白检测仪便可进行纯化，是实验室纯化Ｆ（ａｂ＇）２的理想方法．

单克隆抗体F(ab’)_2片段的制备与质量控制

本文在F(ab’) 2 片段抗体的制备工艺上 ,采用HPLC疏水色谱法 ,用高性能的疏水色谱柱 ,经 2次纯化后的F(ab’) 2 纯度可大于 98% ,回收率大于 5 0 % ,整个过程控制无菌无热原 ,纯化后产品经检定完全符合有关人用鼠源性单抗质量控制标准 ,适宜做大规模生产。

抗体F(ab′)_2片段靶向的载多柔比星免疫毫微粒的构建及其抗肝癌作用

目的 构建抗体F(ab′) 2 片段靶向的载药免疫毫微粒 ;评价F(ab′) 2 片段免疫毫微粒对肿瘤的特异结合性及杀伤作用。方法 采用异型双功能交联剂琥珀酰亚胺基 3 (2 吡啶二硫 )丙酸酯 (SPDP)将抗人肝癌单抗HAb18或对照抗体 4E3的F(ab′) 2 片段与多柔比星 (ADR)人血清白蛋白毫微粒 (ADR HAS NP)共价交联构建抗体F (ab′) 2 片段靶向的载药免疫毫微粒 (HAb18F(ab′) 2 ADR HSA NP ,4E3F (ab′) 2 ADR HSA NP) ;采用玻片凝集试验 ,免疫荧光染色实验确定F(ab′) 2 片段是否结合在毫微粒表面 ;采用花环形成实验 ,花环形成阻断实验 ,扫描电镜分别从光镜、电镜水平观察F(ab′) 2 片段免疫毫微粒是否同人肝癌细胞株SMMC 772 1特异性结合 ;采用MTT比色分析法研究F(ab′) 2 片段免疫毫微粒的体外细胞毒作用 ;采用皮下荷人肝癌裸鼠模型 ,经瘤体注射观察免疫毫微粒的抗人肝癌作用。结果 F (ab′) 2 片段免疫毫微粒圆球状 ,粒径1 2 μm左右 ,免疫荧光染色阳性而ADR HSA NP为阴性 ,提示F (ab′) 2 片段已偶联到ADR HSA NP表面 ;HAb18F(ab′) 2 ADR HSA NP能有效结合于人肝癌细胞株SMMC 772 1,该结合能被HAb18抗体的F(ab′) 2片段阻断 ,未见该免疫毫微粒与对照细胞 (SW 1116)有效结合 ,这些结果提示 ,HAb18F(ab′)

抗竹叶青蛇毒抗体F(ab′)2的制备

目的:制备特异性强、高纯度的抗竹叶青蛇毒抗体F(ab′)2。方法:以竹叶青蛇毒为免疫原免疫马,试血效价达到要求后,从免疫马血浆中先提取IgG,然后酶解、过疏水柱后得到F(ab′)2片段,以免疫扩散实验检测抗体F(ab′)2片段的特异性,以小鼠中和试验测定其中和竹叶青蛇毒的能力。结果:纯化得到的F(ab′)2活性片段纯度可达90%;F(ab′)2冻干品与竹叶青蛇毒在8∶1时出现免疫沉淀线,在20∶1时可保护小鼠100%存活。结论:纯化得到的抗体F(ab′)2活性片段对竹叶青蛇毒具有较好的中和能力。

疏水作用FPLC一步法制备级纯化抗人肝癌单抗HAb18F(ab')_2片段

目的 制备符合人用标准的肝癌单抗 HAb1 8F(ab') 2 片段 .方法 用胃蛋白酶消化经硫酸铵盐析的腹水抗体 ,胃蛋白酶与抗体在 p H3.5 0 .1 mol· L- 1柠檬酸条件下 ,经不同反应时间 ,收集样品 ,上 FPL C(快速蛋白液相色谱 )Phenyl- Sepharose HP疏水柱纯化并进行质检 .结果 按上述条件消化 2 h,95 %以上的 Ig G裂解为 F(ab') 2 片段 ,经Phenyl- Sepharose HP疏水柱纯化后 F(ab') 2 片段纯度可达98.8% .纯化时间仅 5 0 m in,一次制备量可达 5 0 0 mg,回收率>5 0 % ,免疫活性为 1∶ 80 0 0 ,细菌、热原质检测结果为阴性 .结论 该法操作简便 ,周期短 ,易于质控 ,是大量、快速、高产率制备 F(ab') 2 片段的有效方法 .

哇巴因多克隆抗体F(ab)_2片段的制备及其分子量测定

目的制备哇巴因多克隆抗体F(ab) 2 片段 ,并对其进行分子量的测定。方法免疫家兔制备哇巴因多克隆抗体 ,在适宜的条件下 ,用胃蛋白酶酶解哇巴因多克隆抗体 ,制备F(ab) 2 片段。酶解产物经HPSEC分析、纯化 ,ELISA法检测其免疫学活性。并在适宜的色谱条件下 ,分别测定三种标准蛋白的洗脱体积 ,绘制标准曲线 ,测定其分子量。结果 10 0mg哇巴因多克隆抗体在 2mg胃蛋白酶消化 18h ,反应体系pH 3 .0的条件下消化 ,制备出了活性的F(ab) 2 片段 ,其相对分子质量为 10 7kD。结论用胃蛋白酶消化哇巴因多克隆抗体 ,可制备出活性的F(ab) 2 片段 ,同时其相对分子质量的测定为其进一步研究提供了依据。

载^(131)I和阿霉素“双弹头”F(ab′)_2片段免疫毫微粒的抗人肝癌作用

目的研究载131I和阿霉素“双弹头”F(ab′)2片段免疫毫微粒的抗肿瘤效应及其在荷瘤裸鼠体内的分布。方法采用氯胺T法,将核素131I结合到抗人肝癌HAb18抗体的F(ab′)2片段靶向的载阿霉素毫微粒上,构建“双弹头”F(ab′)2片段免疫毫微粒;采用花环形成实验、MTT比色分析法等分别研究该免疫毫微粒对人肝癌细胞株(SMMC-7721)的特异性结合及体外细胞毒作用;应用皮下荷人肝癌裸鼠模型,评价该免疫毫微粒的体内分布及其抗肝癌作用。结果“双弹头”F(ab′)2片段免疫毫微粒能特异性结合于SMMC-7721细胞周围形成花环,其IC50明显低于“单弹头”F(ab′)2片段免疫毫微粒;该免疫毫微粒经尾静脉给药后,主要分布于肝、脾等处,而经瘤体注射主要滞留于瘤体内,其抑瘤率显著高于对照“单弹头”毫微粒。结论载131I和阿霉素“双弹头”F(ab′)2片段免疫毫微粒,具有较“单弹头”F(ab′)2片段免疫毫微粒更佳的抗肿瘤效应。

抗哇巴因多克隆抗体F(ab)_2片段的研制及鉴定

目的 用胃蛋白酶酶解抗哇巴因多克隆抗体 ,制备出F(ab) 2 片段 ,为改型抗体的研究提供依据。方法 免疫家兔制备出抗哇巴因多克隆抗体 ,并用胃蛋白酶分别在不同的酶解条件下消化抗体 ,继之用高效液相排阻色谱法 (HPSEC)对其进行分析、纯化 ,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测、鉴定其活性。结果 用胃蛋白酶 2mg/1 0 0mg抗哇巴因多克隆抗体 ,消化 1 8h ,反应体系的 pH3 0时 ,可获得F(ab) 2 片段。结论 用胃蛋白酶酶解抗哇巴因多克隆抗体是研制出有活性的F(ab) 2

鼠源性单克隆抗体F(ab′)_(2)片段制备工艺

目的 制备符合临床应用质量标准的鼠源性 m Ab F(ab′) 2 片段 .方法 采用胃蛋白酶消化小鼠腹水抗体 ,疏水作用色谱法纯化 F(ab′) 2 片段的新工艺 ,替代原有的木瓜蛋白酶消化 Ig G,阴离子交换色谱法纯化的旧工艺 .结果 新工艺所制备的 F(ab′) 2 片段经 SDS- PAGE检测纯度达 98%以上 ,ABC免疫组化法测定免疫活性为 1∶ 80 0 0 ,回收率大于 5 0 % ,核酸含量及热原均合格 ,整个工艺流程可在 48h内完成 .结论 新工艺制备人用鼠源性 m Ab F(ab′) 2 片段更简便高效、安全实用 。

重组抗人血小板GPⅡb/Ⅲa嵌合单抗F(ab′)_2在Beagle犬体内药动学

目的研究了重组抗人血小板GPIIb/Ⅲa嵌合单抗F(ab′)2经静脉单次给药后在Beagle犬中的药动学。方法按不同时间点采血,分离血浆,采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定犬血浆中嵌合单抗F(ab′)2的浓度,根据非房室统计矩模型进行曲线拟合并计算药动学参数。结果Beagle犬分别静脉单次注射高、中、低(1.2,0.8,0.4mg.kg-1)后,t1/2分别为(7.35±0.65),(8.28±0.68)和(7.03±3.26)h,CLs与Vss随着剂量的减小发生增加的变化,血药浓度-时间曲线下面积AUC0-inf分别为(2453.70±371.59),(1097.64±142.11)和(362.63±169.12)μg.h.L-1,剂量之比为3:2:1,对应的AUC0-inf比值为6.8:3:1,剂量与AUC成正相关性,相关系数R2=0.9714,但是AUC0-inf的增加量大于剂量的增加量。结论在本实验的剂量范围内,剂量与AUC0-inf成正相关性,AUC0-inf的增加量大于剂量的增加量,预示在以上剂量范围内嵌合单抗F(ab′)2在Beagle犬血浆中的浓度变化可能呈非线性药动学规律;动物性别对药动学参数无显著性影响。

抗人肝癌mAb HAb18F(ab′)_2半成品的制备与质量控制

目的制备符合人用标准的抗人肝癌mAbHAb18F(ab′)2 片段。方法用胃蛋白酶消化经硫酸铵盐析的腹水抗体 ,然后在快速蛋白液相色谱(FPLC)上用Phenyl SepharoseHP疏水柱纯化并进行质检。结果经Phenyl SepharoseHP疏水柱纯化后 ,F(ab′)2 片段的纯度可达98.8% ;回收率大于50 % ;免疫活性为1∶8000;细菌、热原质检测均呈阴性。结论本制备工艺周期短、易于质控 ,适宜进行中试放大及半成品生产。

CD20F(ab′)_2抗体的发酵与纯化

转化了质粒PYZcpp3的 16C9大肠杆菌可高水平地分泌表达可溶性CD2 0F(ab′) 2 抗体 ;采用经优化的培养条件 ,在发酵罐上进行高密度培养OD550 值达 14 0 ;每升湿菌菌重 2 0 0g ;抗体的产量每升为 2 4 1mg ,其中F(ab′) 2 片段达 5 0 % ,F(ab′) 2 可以特异性的识别CD2 0 + 细胞并与CD2 0相结合 ;F(ab′) 2 对Raji细胞的IC50 值为 2 2 8μg mL ;而Fab′对Raji细胞的IC50 值为 4 5 9μg mL。

Al2F2分子结构与稳定性的ab initio计算研究

用ab initio方法在UMP2/6-311G(d)水平下计算了Al2F2分子可能的异构体构型和AlF二聚化成Al2F2分子的反应能.UMP2/6-311G(d)和UQCISD(T)/6-311+G(3df)∥UMP2/6-311G(d)水平下的能量值均说明具有D2h对称性、1Ag电子态的异构体是A12F2分子的最稳定构型,其Al-F键长为0.19074nm,键角Al-F-Al和F-Al-F分别为104.62°和75.38°,以及两个强振动,441.27cm-1和401.93cm-1,均与实验结果相符合.电子结构分析表明,具有D2h对称性的异构体的活性中心在2个Al原子上,在形成衍生物时是主要的反应加成位置.在UMP2/6-311G(d)和UQCISD(T)/6-311+G(3df)∥UMP2/6-311G(d)水平下得到了AIF二聚化能量分别为-75.01kJ/mol和-66.07kJ/mol,与文献估计值基本一致,说明AlF二聚化反应在能量上是有利的.

无花果酶制备抗卵巢上皮癌单抗F(ab')_2片段

无花果酶制备抗卵巢上皮癌单抗Ｆ（ａｂ）２片段①李小平钱和年冯捷王建六②李文锦付天云（北京医科大学人民医院妇科肿瘤研究室，北京１０００３４）Ｆ（ａｂ）２制备多采用胃蛋白酶（Ｐｅｐｓｉｎ），但有些抗体对其有抗性，本室曾用其制备ＣＯＣ１６６－９和ＣＯＣ...

高纯度抗五步蛇毒F(ab′)_2血清的制备

目的摸索高纯度抗五步蛇毒血清的制备方法,以降低抗血清治疗毒蛇咬伤时因纯度不高发生的过敏和其他不良反应。方法从免疫后的马血浆中先提取IgG,然后酶解,通过疏水层析得到F(ab′)2片段,以SDS-PAGE电泳确定纯度,以小鼠体外中和试验确定F(ab′)2活性片段的中和能力。结果制备的抗五步蛇毒血清F(ab′)2冻干品纯度质量分数为91.3%,中和五步蛇毒干粉质量比为15∶1。结论采用新方法制备的F(ab′)2活性片段纯度质量分数能从70%提高到90%以上。

抗人肝癌单抗片段抗体HAb18F(ab')_2的冻干工艺研究

选择适合于HAb18F(ab')2片段抗体的冻干保护剂及其冻干工艺,是确保该生物制品的质量关键之一,对不同种类和不同浓度的保护剂进行了研究,结果表明10%蔗糖对HAb18F(ab')2片段抗体冻干样品的剂型、外观、残水量(<3%)、复溶时间(<10s)、纯度(>95%)及稳定性没有影响。研究优化与保护剂相结合的适用于HAb18F(ab')2片段抗体的最佳冻干工艺,为抗体片段扩大生产提供依据。

马破伤风免疫球蛋白F(ab′)_2及其临床应用前景

破伤风在现今医疗条件下的死亡率仍高达10%。长期以来,破伤风防治主要依赖破伤风抗毒素(TAT),后者主要含有马破伤风免疫球蛋白F(ab′)2和特异性抗体免疫球蛋白G(IgG)。经过多年的工艺改进,新制品马破伤风免疫球蛋白F(ab′)2因提高了可中和破伤风毒素的有效成分F(ab′)2的含量,同时降低了会引起过敏反应的主要成分IgG的含量、使不良反应发生率降低,具有良好的临床应用前景,是TAT的升级换代制品。