日本血吸虫病常用诊断方法现场查病效果的评估

目的评估几种常用血吸虫病诊断方法现场查病的效果。方法2005年11月,选取江西省鄱阳湖沿岸3个血吸虫病流行村的6～65岁居民为调查对象,用改良加藤厚涂片法(Kato-Katz法,3张涂片)和尼龙绢集卵孵化法进行病原学检测的同时,分别用胶体染料试纸条法(DDIA)、快速酶联免疫吸附试验(F-ELISA)及2种间接红细胞凝集试验(IHA-A和IHA-B)进行血清学检测,以评价该几种检测方法的效果。结果3村共检测居民1864人,平均粪检阳性率为9.7%。改良加藤法在血吸虫病中度、重度流行区的漏检率相对稳定,为20.0%～27.8%;尼龙绢集卵孵化法的漏检率在每克粪便虫卵数(EPG)>100时相对稳定(约25%)。DDIA、F-ELISA、IHA-A和IHA-B的平均阳性率分别为47.8%、50.0%、66.3%和40.1%。以病原学检测结果为金标准,DDIA、F-ELISA、IHA-A和IHA-B的敏感性分别为75.3%、65.8%、85.6%和76.0%;特异性为55.1%、51.7%、35.7%和63.6%。与其他几种免疫血清学诊断方法相比,IHA-B试剂的特异性、Youden指数、阳性似然比及粪检符合率最高。DDIA法与IHA-B法的符合率最高(77.3%),而F-ELISA和IHA-A的符合率最低(61.5%)。结论在血吸虫病中、重度流行区,改良加藤法虫卵检出率和稳定性均优于尼龙绢集卵孵化法;IHA-A的敏感性最高,IHA-B的4个指标最高,具有较高的现场使用价值,但需进一步提高其敏感性。

日本血吸虫快速酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的应用研究

目的 探讨日本血吸虫快速酶联免疫吸附试验 (F- EL ISA )抗体检测试剂盒检测日本血吸虫病的特异性、敏感性及与其他寄生虫病的交叉反应。方法 采用 F- EL ISA法检测日本血吸虫急性、慢性及晚期病人血清中抗 SEA抗体和健康人、并殖吸虫、肝吸虫、囊虫及旋毛虫病患者血清中的交叉抗体。结果 检测急性、慢性及晚期血吸虫病人的敏感性分别为 10 0 %、95 .19%和 77.78% ,检测正常人的特异性为 98.46 % ,与并殖吸虫、肝吸虫、囊虫及旋毛虫病人的交叉反应率分别为11.6 3%、7.5 5 %、0和 13.33%。结论 F- EL ISA检测日本血吸虫病具有敏感性高、特异性强、快速简便等优点 。

胶体金免疫渗滤法检测日本血吸虫病血清抗体的研究

应用建立的胶体金免疫渗滤法检测日本血吸虫病血清抗体,并以快速酶联免疫吸附试验(F-ELISA)方法检测作平行对照。现场和实验室试验表明,胶体金渗滤法与F-ELISA方法在敏感度和特异度的差异无统计学意义(P>0.05),两法具有较高的一致性。但胶体金免疫渗滤法操作简便快速,无特殊要求,在临床和现场防治工作中具有比较广泛的应用前景。

湖北光敏核不育水稻幼穗发育中1AA的变化

利用IAA酶联免疫检测技术,测定了农垦58S及农垦58幼穗发育中长(LD)、短(SD)日照下IAA含量。结果表明:农垦58S在LD下叶片中F-IAA在花粉母细胞形成期、减数分裂期和花粉内容物充实期大量积累,而同期幼穗及花药中F-IAA严重亏缺,农垦58S SD、农垦58 SD及农垦58 LD均不表现此现象。据此认为这种现象是导致农垦58S LD败育的重要生理原因。C-IAA的测定表明:农垦58S及农垦58长短日下也不表现上述积累与亏缺现象,且农垦58S LD下的C-IAA变化与F-IAA的积累与亏缺无关。

养殖刺参腐皮综合征两种致病菌Dot-ELISA快速检测

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征两种主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清,建立了两种病原菌的点酶ELISA(Dot-ELISA)检测方法。根据方正试验,确定检测用一抗、二抗最佳工作稀释度:灿烂弧菌抗血清稀释度320,酶标二抗稀释度3 000;假交替单胞菌抗血清稀释度160,酶标二抗稀释度2 000。阻断试验结果表明两种抗血清特异性均较高。灿烂弧菌抗血清在稀释度为40时与溶藻胶弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等弧菌发生微弱交叉反应,提高稀释度到160时,不发生交叉反应。假交替单胞菌抗血清基本不与常见海水致病弧菌发生交叉反应。人工感染试验检测结果表明该方法能从患病海参溃烂组织、未发病海参组织和感染水体检测到相应致病菌,检测灵敏度为9.4×103个/mL。人工感染试验检测结果经直接凝集反应验证。该方法操作简便、灵敏度高,不需复杂仪器设备,适合在基层推广。

间接ELISA检测犬瘟热血清抗体方法的建立

以重组表达的犬瘟热病毒融合蛋白(fusion protein,F)作为包被抗原,建立了检测犬瘟热病毒血清抗体的间接ELISA方法。所建立的间接ELISA抗原包被浓度为125ng/孔,血清最佳稀释度为1∶160。经阻断试验、重复性试验等表明该方法特异性强、重复性较好,可用于犬瘟热血清抗体的定量和定性检测。

四种诊断血吸虫病方法的比较研究

本文对血吸虫病监测中的COPT、IHA、PVC-IEST和F-ELISA4种血清免疫诊断方法进行了比较.4种方法的敏感性依次为70.45%、65.91%、54.55%、68.18%,假阳性率均不超过5.00%,4种方法的操作时间和劳动强度以COPT为最长、最大,其余3种方法较为接近,成本费用以IHA最低.作者认为,在血吸虫病巩固监测地区,可用IHA和F-ELISA法结合门诊肝功能血清检查进行监测,有史者加做COPT,阳性者可作病人处理.疫区暂住人员监测可用PVC-IEST和IHA检测,两种方法均阳性者可作病人处理.

纸纤维固定木瓜蛋白酶的研究及应用

利用纸纤维为载体,制备高活性的固定化木瓜蛋白酶并应用于抗HCG抗体的水解.利用戊二醛交联法,制备固定化木瓜蛋白酶,并通过一系列优化,得到最佳固定化条件,包括pH﹑给酶量﹑温度﹑戊二醛体积分数,将制备的固定化木瓜蛋白酶应用于抗HCG抗体水解并制备F(ab′)2片段.研究表明:反应温度为40℃时,固定化酶在pH 5.0,0.01mol/L的醋酸缓冲液条件下,给酶量为46mg/g载体,戊二醛体积分数为0.01%时,固定化酶的酶活达到最高19 250U/g,相对于优化前1 940U/g提高了近10倍,成功应用于抗HCG抗体水解制备F(ab′)2片段:经SDS-PAGE电泳检测,F(ab′)2片段达到电泳纯.ELISA反应检测表明:片段仍保留较高的活性,效价为1∶12 000.

标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中主要变应原Der f 2含量测定

目的研制粉尘螨Ⅱ组变应原Der f 2单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb),并建立双单抗夹心ELISA检测方法 ,测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f 2的含量。方法应用基因工程方法获得粉尘螨变应原Der f2重组蛋白并通过亲和层析纯化,再免疫小鼠,利用间接ELISA筛选获得McAb杂交瘤细胞株并纯化、鉴定抗体的特异性;用一株单抗包被酶标板,同时用生物素标记另一株单抗,从而建立双单抗体夹心ELISA法;并用此法测定粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f2的含量。结果成功地获得了一株单抗3B12与屋尘螨抗原具有交叉反应,另外一株单抗3G7与屋尘螨抗原没有交叉反应,并建立了双单抗夹心ELISA方法测定Der f2的含量,其方法的检测限为0.5ng/mL,并在6.25ng/mL-300ng/mL范围内线性良好;标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f2的含量为100ng/10000BAU。结论成功制备了高效价抗Der f 2单抗,并建立了双抗体夹心ELISA检测方法。该方法具有很高的灵敏度,可以测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中主要变应原Der f 2含量,为临床应用奠定基础。

鹅源新城疫病毒F基因的原核表达及间接ELISA诊断方法的建立

参照GenBank公布的鹅源新城疫病毒NA-1株F基因(DQ659677)的核苷酸序列设计1对引物,通过PCR扩增F基因全长,将其克隆到pET-22b(+)载体中,构建了原核表达载体pET-22b(+)-F,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化了重组蛋白,Western-blot证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为包被抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为0.21μg/孔,建立了检测鹅源新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。

血浆凝血因子ⅩⅢ抗原及活性的测定

目的 建立血浆F抗原及活性定量测定的方法。方法 对 4 6例正常人及两个遗传性F缺陷症家系部分成员采用双抗体夹心法检测F抗原 ,生物素化戊胺测定F活性 ,以F标准品建立标准曲线。结果 3例患者FA :Ag均为 0 % ,FB :Ag分别为正常人的 78.4 6 %、6 6 .4 3%、5 7.2 9%。 4 6例正常人血浆F活性F∶C平均值为 86 .34%± 17.98% ,范围在5 6 .5 %～ 16 5 .17%之间 ,3例患者为 0 % ,家系中杂合子范围为 2 9.6 0 %～ 10 4 .86 %。结论 双抗体夹心法和生物素标记法均为简捷、灵敏而且特异的F测定方法。

应用酶联免疫吸附分析法评价大麦品种对黄花叶病毒的抗性

选用国内外大麦种质资源384份，分别种植于上海、江苏和浙江三省市的3个病圃中。用F（ab’）2－ELISA检测带毒情况，并进行田间发病率调查。结果有364份大麦品种经血清学检测与田间发病相符，发病轻重与植株内病毒含量基本一致。另有20份大麦品种经检测为阳性，但田间未查到明显病株，为隐症带毒。

肝特异性F抗原ELISA检测法的建立及其临床应用研究

应用两株抗人肝特异性Ｆ抗原的单克隆抗体建立测定血清Ｆ抗原的夹心ＥＬＩＳＡ法。结果显示本法标准曲线工作范围（５ － ２００）μｇ／ｍｌ，平均回收率９５ ．６ ％ 。正常对照、良性肝病、急性肝炎、肝硬化、肝癌患者Ｆ抗原含量（μｇ／ｍｌ） 分别为０ ．２０ ±０．０７ 、０ ．４５ ±０ ．１４ 、３５ ．５０ ±８ ．４０ 、２２ ．１６±７ ．１２ 、４１．５０ ±１４ ．１７ ，其中急性肝炎及肝癌血清Ｆ抗原水平显著升高。该法可为肝损伤，尤其是肝癌提供早期辅助诊断。

重组抗人血小板GPⅡb/Ⅲa嵌合单抗F(ab′)_2在Beagle犬体内药动学

目的研究了重组抗人血小板GPIIb/Ⅲa嵌合单抗F(ab′)2经静脉单次给药后在Beagle犬中的药动学。方法按不同时间点采血,分离血浆,采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定犬血浆中嵌合单抗F(ab′)2的浓度,根据非房室统计矩模型进行曲线拟合并计算药动学参数。结果Beagle犬分别静脉单次注射高、中、低(1.2,0.8,0.4mg.kg-1)后,t1/2分别为(7.35±0.65),(8.28±0.68)和(7.03±3.26)h,CLs与Vss随着剂量的减小发生增加的变化,血药浓度-时间曲线下面积AUC0-inf分别为(2453.70±371.59),(1097.64±142.11)和(362.63±169.12)μg.h.L-1,剂量之比为3:2:1,对应的AUC0-inf比值为6.8:3:1,剂量与AUC成正相关性,相关系数R2=0.9714,但是AUC0-inf的增加量大于剂量的增加量。结论在本实验的剂量范围内,剂量与AUC0-inf成正相关性,AUC0-inf的增加量大于剂量的增加量,预示在以上剂量范围内嵌合单抗F(ab′)2在Beagle犬血浆中的浓度变化可能呈非线性药动学规律;动物性别对药动学参数无显著性影响。

抗孕酮Fab’的制备和鉴定

利用酶联免疫测定法(ELISA)测定乳中孕酮含量来进行妊娠诊断的的方法有很多,采用二级竞争酶联免疫法可提高反应的灵敏度,但操作可进一步简化。通过制备抗孕酮Fab'可简化该操作。实验采用硫酸铵沉淀法对兔抗孕酮血清进行粗提,再用DEAESepharoseFastFlow对IgG作进一步纯化,回收率为93.24%。用胃蛋白酶将IgG消化成F(ab')2,回收率为73.75%。F(ab')2用10mmol/L巯基乙醇在pH6.0,37℃条件下反应2h而被还原成Fab',回收率为67.84%。最后对IgG、F(ab')2、Fab'进行SDS-聚丙酰胺凝胶电泳其分子量分别接近于150000、92000、46000。

基于牛呼吸道合胞体病毒融合前F蛋白的间接ELISA方法的建立与应用

为确定牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)在我国的流行情况,本研究以BRSV融合前F蛋白作为包被抗原,经各项条件优化后建立了检测BRSV抗体的间接ELISA方法:确定抗原最佳包被浓度为2 mg/L、待检血清的最佳稀释度为1∶100、最佳封闭液为3%明胶、羊抗牛Ig G-HRP的稀释度为1:8000,抗体阴阳性临界值为0.204。特异性试验结果显示,该ELISA方法与阿卡斑病毒(AKAV)、牛轮状病毒(BRV)、蓝舌病病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)以及牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的阳性血清无交叉反应。敏感性试验结果显示,当BRSV阳性血清稀释倍数达1∶6400时仍为阳性结果,表明该方法具有较高的敏感性。重复性试验结果显示,ELISA组内、组间最大变异系数分别为6.80%和8.80%,表明该方法的重复性良好。对195份临床牛血清样品检测结果显示,BRSV抗体阳性率为61.0%;对其中的143份血清同时进行病毒中和试验检测,结果显示二者符合率为89.5%。上述结果表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于牛群中BRSV抗体的检测,为BRSV的血清流行病学调查提供可靠的技术手段。

应用木瓜酶消化抗甲胎蛋白单克隆抗体制备F(ab′)_2片断

用胃酶消化抗甲胎蛋白单克隆抗体（简称AFPMcAb）制备F（ab′）2片断，反应时间长，且F（ab′）2产量低。改用半胱氨酸活化的木瓜酶，在没有半胱氨酸存在的条件下消化AFPMcAb。反应4小时后．SDS－PAGE电泳结果显示，90％以上的AFPMcAb被降解为F（ab′）2片断、经S－200层析柱纯化后，F（ab′）2片断的回收率为理论值的48％。用双抗体夹心竞争抑制ELISA法测定经S－200纯化的AFPMcAbF（ab′）2片断的活性。其活性与完整的AFPMcAb相同。抑制效价均为1：6400。

马铃薯种薯青枯病菌的NCM-ELISA检测

利用NCM-ELISA方法对来自云南省3个县(市)50个样本的马铃薯种薯青枯病菌的带菌量进行检测,检查是否具有青枯病潜在感染。结果表明:寻甸的24个样品中11个带菌;宣威的17个样品中10个带菌;来自昭通的所有样品都不带菌。其中马铃薯主栽地区的主栽品种的青枯病潜在感染量较大。

绿色无毒黄曲霉毒素B_1免疫检测方法

建立了一种基于抗独特型抗体的绿色无毒的ELISA方法，并用于检测面粉中黄曲霉毒素B1。通过酶解2种抗黄曲霉毒素小鼠单克隆抗体（11A9和1G3）制备F（db’）2片段，并将其免疫新西兰大白兔制备抗独特型抗体。最终得到两种抗独特型抗体，并对抗独特型抗体和AFB。进行相关性分析。通过实际样品添加回收，其批内回收率为115．60％～121．88％，变异系数在5％以内；而批间回收率为111．89％～126．98％，变异系数低于8％。分析结果准确可靠，表明此无毒绿色ELISA是一种安全可靠的AFB1分析方法。

玉米赤霉烯酮多克隆抗体的制备及特性分析

合成玉米赤霉烯酮半抗原,应用液相色谱-质谱联用法进行鉴定,并采用活泼酯法将半抗原与载体蛋白OVA或BSA偶联,分别作为免疫原或包被原,并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和紫外扫描法鉴定偶联效果,免疫3只BALB/c小鼠,制备玉米赤霉烯酮多克隆抗体。结果表明:抗血清效价最高达1∶32 000,以此多抗建立的玉米赤霉烯酮间接竞争标准曲线IC50为39.8ng/mL,IC10为0.71ng/mL,多抗与玉米赤霉烯酮类似物β-zearalenol、zear-alanone、α-zearalanol、β-zearalanol交叉反应率分别为4.80%,3.07%,0.96%,0.09%。说明试验成功制备了玉米赤霉烯酮人工抗原及高特异性多克隆抗体。