鞘氨醇-1-磷酸受体激动剂芬戈莫德对黑色素瘤B16-F10增殖和迁移的影响及机制

目的观察芬戈莫德对黑色素瘤B16-F10细胞的增殖和自噬相关蛋白的影响。方法将含有不同浓度芬戈莫德(0、5、10、15μM)的DMEM培养基培养B16-F10细胞24 h,利用CCK-8细胞活力检测试剂盒检测各组细胞活力;划痕实验检测用药后B16-F10细胞的迁移能力;台盼蓝染色检测细胞的死活;利用免疫荧光实验和免疫印迹实验检测用药后细胞内自噬相关通路蛋白的表达情况。结果芬戈莫德可显著抑制B16-F10细胞的活力和增殖能力,并呈现剂量依赖性;芬戈莫德减弱B16-F10细胞的迁移能力并引起细胞死亡;免疫荧光和免疫印迹实验显示,与Control组相比,FTY-720组的细胞自噬通路相关蛋白LC3、Beclin1和P62的表达均出现改变(P<0.05)。结论芬戈莫德可抑制黑色素瘤B16-F10细胞的增殖并引起细胞损伤,其机制可能与芬戈莫德引起黑色素瘤B16-F10细胞的自噬有关。

负载MnO_(2)纳米颗粒的可得然复合水凝胶的构建及其联合光热疗法对黑色素瘤B16-F10细胞的杀伤效果

目的:构建负载二氧化锰(MnO_(2))纳米颗粒的可得然(Cur)复合水凝胶MnO_(2)@Cur(简称MGel),研究其对黑色素瘤B16-F10细胞的杀伤效果。方法:采用热诱导法制备Cur水凝胶(Gel),物理负载MnO_(2)构建MGel,表征其宏观和微观形貌,检测其机械性能、降解性能以及光热转换性能等理化性能,并研究其联合PTT对小鼠皮肤黑色素瘤B16-F10细胞的光热杀伤效果。结果:MGel具有优异的机械和可降解性能,抗拉伸强度达(127.97±3.60)kPa、抗压缩强度达(151.44±5.23)kPa,28 d降解率约58.17%。MGel负载MnO_(2)纳米片(粒径约180 nm)获得优异的光热转换性能,负载1.0 mg/mL MnO_(2)的MGel在1.0 W/cm^(2)的808 nm NIR光照4 min后到达最高温度50℃。细胞毒性实验和Calcein-AM/PI荧光双染色实验表明,MGel联合PTT有效杀伤B16-F10黑色素瘤细胞,NIR光照使得MGel组细胞存活率降低至(4.68±0.66)%(P<0.0001)。结论:MGel复合水凝胶具备优异的机械性能、可降解性能以及光热转换性能,其联合PTT能有效杀伤肿瘤细胞,可能成为一种有效治疗黑色素瘤的新手段。

黄腐酚逆转B16-F10黑色素瘤细胞恶性表型

本研究从体外增殖、细胞周期分布、克隆形成和迁移能力、黑色素合成以及糖酵解水平等考察了黄腐酚(XN)对B16-F10高转移潜能小鼠黑色素瘤细胞恶性表型的影响。结果表明,XN明显抑制B16-F10细胞增殖、克隆形成和体外迁移,阻滞细胞周期于G0/G1期,并上调细胞黑色素合成水平。同时发现XN下调B16-F10细胞的葡萄糖摄取,降低乳酸脱氢酶和己糖激酶活性及NAD^(+)/NADH比率,下调缺氧诱导因子1(HIF-1α)和沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)表达。另外,XN明显延长荷B16-F10黑色素瘤小鼠生存期。总之,本研究表明XN逆转B16-F10黑色素瘤恶性表型,并发挥抗肿瘤增殖和转移活性,或与其调控肿瘤糖代谢效应相关。

中空硫化铜纳米酶脂质复合载体的制备及其联合激光杀伤黑色素瘤B16-F10细胞

目的:构建中空硫化铜纳米酶脂质复合载体CuS@LIP并探讨其联合激光照射杀伤黑色素瘤B6-F10细胞的效果与机制。方法:构建(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺-丙烷(氯盐)(DOTAP)阳离子脂质体包被硫化铜纳米载体CuS@LIP,研究不同质量浓度的CuS与CuS@LIP在1 064 nm激光照射下的光热性能和热稳定性,通过H_(2)O_(2)与3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)催化活性检测体系检测CuS@LIP的类过氧化物活性;用系列质量浓度梯度的CuS、CuS@LIP在有/无激光条件下分别处理B16-F10细胞,CCK-8法检测细胞的存活率,Calcein-AM/PI染色法、AnnexinⅤ-FITC/PI染色法结合流式细胞仪分别检测20μg/mL CuS或CuS@LIP在激光照射或非激光照射条件下对B16-F10细胞活力和凋亡的影响。结果:成功制备的CuS@LIP的平均粒径为(178.23±6.46)nm,平均Zeta电位为(20.47±0.93)mV;在激光照射下,80μg/mL CuS@LIP最高温度可达65.4℃,比单纯CuS的63.4℃更高;经3个激光开关周期测试,CuS@LIP终点温度基本保持不变;此外,CuS@LIP与CuS具有相同的类过氧化物酶催化活性。低于20μg/mL的CuS@LIP在体外对B16-F10细胞的增殖活性没有明显影响(P>0.05),但联合激光照射后细胞存活率明显降低(29.76±3.60)%vs(87.95±8.18)%,P<0.000 1,细胞凋亡率显著升高[(19.34±4.41)%vs(13.36±0.86)%,P<0.01]。结论:制备的CuS@LIP具有符合设计要求的理化性质、良好的光热性能和优异的类过氧化物酶催化活性,其与激光照射联合后显示出更优异的杀伤B16-F10细胞的效果。

Inhibitory effect of Cyrtomium falcatum on melanogenesis in α-MSH-stimulated B16F10 murine melanoma cells

Objective:To explore the anti-melanogenic potential of Cyrtomium falcatum.Methods:The effects of Cyrtomium falcatum crude extract and its solvent fractions on tyrosinase activity,melanin content,and the expressions of melanogenesis-related genes and proteins were analyzed inα-melanocyte-stimulating hormone(α-MSH)-stimulated B16F10 cells.Results:α-MSH treatment significantly increased tyrosinase activity,and extracellular and intracellular melanin content,as well as the expression levels of tyrosinase,microphthalmia-associated transcription factor(MITF),tyrosinase-related protein(TRP)-1,and TRP-2 in B16F10 cells.Treatment with Cyrtomium falcatum crude extract and its solvent fractions reduced tyrosinase activity and extracellular and intracellular melanin content and downregulated the expression levels of tyrosinase,MITF,TRP-1,and TRP-2 in a dose-dependent manner.Conclusions:Cyrtomium falcatum has potential anti-melanogenesis effects and can be used as a potential source material in cosmeceutical industry for the research and development of novel lead molecules with whitening properties.

葡萄胎病理相关新基因F10重组蛋白的表达及鉴定

目的 F10是从葡萄胎组织中克隆的新基因,前期研究显示F10基因可能与滋养细胞侵袭性有关,为进一步研究F10基因功能,拟构建原核质粒表达葡萄胎相关新基因F10重组蛋白,分离纯化并鉴定。方法用逆转录聚合酶链反应法从人组织中扩增F10基因编码序列,将其克隆到pET28a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达F10基因重组蛋白,用层析柱予以纯化并采用SDS-PAGE电泳鉴定。结果成功构建了pET28a/F10原核表达质粒,并获得高纯度的重组F10蛋白。结论表达及纯化的重组F10蛋白纯度高,适合作为制备单克隆抗体的抗原,可用于F10功能的进一步研究。

葡萄胎病理相关基因F10编码蛋白单克隆抗体的制备与应用

目的构建原核质粒表达葡萄胎相关新基因F10重组蛋白,分离纯化制备其单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法用逆转录聚合酶链反应法从成人组织中扩增F10编码序列,将其克隆到p ET28a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达F10基因重组蛋白。以纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。ELISA法检测杂交瘤细胞分泌F10单克隆抗体的效价和类型,免疫组织化学染色检测F10蛋白在葡萄胎及胎盘组织中的表达,鉴定制备F10单克隆抗体的特异性。结果成功构建了p ET28a/F10原核表达质粒并获得高纯度的重组F10蛋白。筛选出3株能稳定分泌抗F10蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞系,其效价比高达1∶7.2×105,免疫球蛋白类型均为Ig G1类。免疫组织化学染色显示该抗体能特异结合葡萄胎及胎盘绒毛组织中的F10蛋白,且葡萄胎组织中F10蛋白的表达显著高于正常胎盘组织。结论表达及纯化的重组F10蛋白纯度高,免疫原性强。以此为抗原制备的抗F10蛋白的单克隆抗体效价高、特异性强,可用于F10功能的进一步研究。

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:表达F10蛋白,并制备兔抗F10多克隆抗体。方法:利用PCR方法扩增F10基因片段,经BamH I和EcoR I酶切后连接入pET-GST原核表达载体,构建的pET-GST/F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS-PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗F10的多克隆抗体,并以ELISA法检测抗体效价。结果:经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS-PAGE电泳分析显示pET-GST/F10诱导后表达一相对分子质量(Mr)约为61 000的融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90%以上,Western blot证实该蛋白是GST/F10的融合蛋白。将纯化的GST/F10融合蛋白免疫家兔,得到的兔抗F10抗体效价达1∶20 000。结论:成功构建了人F10基因原核表达载体,并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体,为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。

F10基因过表达对A549细胞致瘤性的影响

目的探讨F10基因过表达对肺癌A549细胞裸鼠成瘤的影响及其机制。方法取SPF级裸鼠（4~5周龄）18只,随机均分为A549-WT组、Mock-A549组和F10＋A549组（n=6）,依次接种野生A549细胞（A549-WT）、转染了空载体的对照细胞株（Mock-A549）和已构建的过表达F10基因的A549细胞（F10＋A549）5×106个于颈背部皮下。接种后每3～4d称体重并观察,记录肿瘤发生时间,绘制在体肿瘤生长曲线,计算各组裸鼠的成瘤率。各组裸鼠于接种5周后处死,进行大体观察后取瘤组织块制备石蜡切片,HE染色后行病理组织学观察,并采用免疫组化法检测Caspase-3、Bax和Bcl-2在瘤组织中的表达。结果 A549-WT组、Mock-A549组和F10＋A549组裸鼠的成瘤时间分别为12.0±1.4、11.7±1.0、8.5±1.4d,组间比较差异有统计学意义（F=13.523,P=0.000）,A549-WT组和Mock-A549组裸鼠成瘤时间长于F10＋A549组（P〈0.05）,而前两组比较差异无统计学意义（P=0.660）。大体观察可见,F10＋A549组成瘤体积较A549-WT和Mock-A549组明显增大。F10＋A549组肿瘤的在体生长速度较A549-WT和Mock-A549组增快,差异有统计学意义（P〈0.05）,而后两组间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。肿瘤组织HE切片显示,A549-WT和Mock-A549组成瘤组织中存在较多坏死细胞,HE染色表现为均质红染、无定形物质结构,而F10＋A549组成瘤组织边缘细胞坏死较少,细胞增生明显,且肿瘤组织局部可见微血管生成。免疫组化检测显示,Bcl-2蛋白在A549-WT和Mock-A549两组瘤组织中几乎无表达,而在F10＋A549组瘤组织中表达较多,阳性细胞呈弥漫性分布。Bax和Caspase-3蛋白在A549-WT和Mock-A549两组瘤组织中的表达均较强,尤以A549-WT组为显著,但在F10＋A549组瘤组织中表达均很弱。结论 F10基因可通过下调Caspase-3和Bax表达、上调Bcl-2表达而增强肺癌A549细胞株在裸鼠体内的致瘤性。

环保型绝缘介质C5F10O放电分解特性

近期,CnF2nO类物质得到了替代气体研究领域的关注,尤其是C5F10O和C6F12O,两者均具有极低的温室效应潜能指数（global warming potential,GWP）且绝缘特性优异。由于其出色的绝缘表现,国内外科研机构和公司开始关注该物质及其混合气体,目前针对其放电分解特性的研究较少。该文基于密度泛函理论从微观层面对C5F10O的稳定性及可能的分解路径展开分析,首先计算得到C5F10O的电离能等参数,并基于前线分子轨道理论确定分子结构中可能发生反应的位置。其次,分析C5F10O可能的分解途径、分解产物的形成机制并计算得到相应的能量变化。最后,利用气体绝缘试验平台对C5F10O/N2混合气体进行击穿测试,基于气相色谱质谱联用仪对击穿前后气室内气体组分进行分析,探讨分解产物的绝缘性能及放电过程中各类粒子的动态平衡过程。研究结果表明,C5F10O放电分解形成CF3CO·、C3F7·或C3F7CO·、CF3·自由基的过程最容易发生,各类自由基进一步反应将生成CF4、C2F6、C3F8、C3F6、C4F10、C5F12、C6F14,上述产物均具有较强的绝缘性能,且C5F10O分子与自由基间存在动态平衡过程,两者共同保障了体系的绝缘性能。试验发现随着击穿次数的增加,C5F10O各分解产物含量增加,其中CF4、C2F6、C4F10的增长率高于C3F8、C6F14,自由基更易于复合形成小分子产物。相关结论对进一步探究C5F10O混合气体的绝缘特性及协同效应等课题提供一定理论依据,同时为CnF2nO类新型环保型介质研究提供一些借鉴。

葡萄胎发病新基因F10在原发性肝癌中的表达分析

目的通过检测原发性肝细胞癌中F10基因的表达,探讨该基因对肝细胞癌发生和发展的可能作用。方法采用地高辛标记F10探针,原位杂交检测人肝细胞癌组织及癌旁组织F10基因的表达水平;通过实时荧光定量PCR方法,在PEABI7000型荧光定量PCR仪上检测肝细胞癌患者手术切除的癌组织及癌旁组织F10基因拷贝数。结果原位杂交结果表明肝癌组织F10基因阳性表达,癌旁组织F10基因不表达;荧光定量PCR显示8例肝细胞癌标本中有6例肿瘤组织中F10基因表达明显高于癌旁组织,其中2例高出4倍以上。结论原发性肝癌组织中存在F10基因的高表达,相应的癌旁组织中未见其表达,提示F10基因在肝细胞癌的发生、发展中起一定的作用。

乌贼墨多糖提取物的制备及其对B16F10细胞的影响

为了探索乌贼墨多糖(SIP)对体外培养的B16F10细胞的生物学效应,以乌贼墨为原材料,对SIP进行提取分离,并研究SIP提取物对B16F10细胞活力、细胞内酪氨酸酶活性及黑色素合成等的影响。结果表明,SIP提取的最优条件为提取温度40℃,料液比1∶3,提取时间4h,提取次数3次,在此条件下SIP得率为14.12 mg·g^(-1)。SIP提取物对B16F10细胞形态有一定影响,对细胞活性、酪氨酸酶活性和黑色素合成均有一定抑制作用,且呈现一定剂量效应。综上可知,SIP提取物能抑制黑色素合成,具有作为美白剂的发展前景,这为乌贼墨合理利用提供了一定科学依据。

F10基因对细胞中PCNA和Cyclin D1表达的影响

【目的】确定F10基因表达对细胞生长的影响,明确F10基因的功能。【方法】构建F10基因的真核表达载体,转染重组pRc-CMV2-F10质粒于肺癌细胞系A549,筛选并获得稳定表达F10基因的细胞克隆A549-F10。通过MTT实验和流式细胞检测F10对细胞生长的影响;通过免疫组化检测细胞中增殖核抗原(PCNA)和细胞周期素D1(cyclinD1)的表达。【结果】转基因的G418抗性克隆能够检测到F10表达。MTT和流式结果显示F10有促进细胞增殖的作用。阳性克隆的细胞株中PCNA和cyclinD1相对较高水平的表达。【结论】F10基因通过上调PCNA和cyclinD1的表达,促进细胞的生长增殖。

葡萄胎发病相关新基因F10功能的初步研究

目的研究与葡萄胎发病相关的新基因F10的功能。方法培养A549细胞,实验分4组:正向F10基因、反向F10基因、空载体分别转染A549细胞组、空白细胞组。转染24h提取细胞mRNA,用差异显示(DDPCR)方法筛选4组之间差异表达的基因。结果获得差异表达的条带,二次PCR扩增后产物连接T载体并测序分析,结果与GenBank数据库中的序列进行同源比较,筛选出几个差异表达的基因,经荧光定量PCR证实annexin I(钙依赖、磷脂结合蛋白)、STAT1(信号转导子与转录激活子)、BASP1在正向F10基因转染组高表达。IPLA2、DATF1在正向F10基因转染组低表达。结论F10基因可能是与细胞增殖和凋亡相关的基因。

甘草查尔酮A抑制小鼠黑色素瘤B16F10细胞增殖机制研究

目的研究甘草查尔酮A抑制B16F10细胞增殖机制。方法 SRB法检测甘草查尔酮A对B16F10细胞增殖影响,Giemsa染色法观察细胞形态变化,比色法检测B16F10细胞内、外黑色素含量,Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡率,流式细胞术测定细胞周期分布,Q-PCR法检测细胞凋亡相关基因B淋巴细胞-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞周期蛋白(Cyclin E2)和细胞周期蛋白依赖性激酶-2(CDK2)的mRNA表达。结果甘草查尔酮A能有效抑制B16F10细胞增殖,呈现浓度依赖性和时间依赖性;随药物浓度增加,细胞增殖速度降低,细胞形态由树突状变为固缩圆球状,并伴有黑色素颗粒物出现,且细胞内、外黑色素含量呈浓度依赖性增加趋势,甘草查尔酮A能使细胞阻滞在G1期,在低浓度时,诱导细胞分化,高浓度时,诱导细胞凋亡;同时,甘草查尔酮A下调凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比率,抑制周期相关蛋白Cyclin E2、CDK2的mRNA表达。结论甘草查尔酮A抑制B16F10细胞增殖机制可能是通过使B16F10细胞G1期阻滞,进而诱导细胞分化和凋亡。

光甘草定诱导小鼠黑色素瘤B16F10细胞凋亡的机制研究

通过体外和体内模型研究光甘草定对小鼠黑色素瘤B16F10细胞增殖的抑制作用及其分子机制。B16F10细胞经光甘草定处理后可抑制其增殖,且具有浓度依赖性;诱导B16F10细胞凋亡,观察到明显的细胞凋亡状态,细胞内凋亡相关基因及蛋白Bax表达显著上升,Bcl-2则表达下调。进一步的研究发现,经光甘草定处理后的B16F10细胞中,培养基中葡萄糖含量升高,而ATP含量、乳酸生成均降低;细胞内糖酵解相关基因及蛋白HK2、Ldha表达下调。同时,经光甘草定处理后,移植瘤小鼠的肿瘤组织生长受到明显抑制,肿瘤组织内细胞凋亡率显著升高,Bax表达明显上升,而Bcl-2、HK2和Ldha则表达均下调。说明,光甘草定在一定浓度范围内抑制了小鼠黑色素瘤B16F10细胞的增殖,诱导细胞凋亡,而其诱导细胞凋亡的机制可能与调控糖酵解相关基因的表达相关。

F10基因对转录因子NF-κB、AP1活性的影响

目的:研究F10基因对转录因子NF-κB、AP1活性的影响。方法:质脂体共转染F10基因和报道质粒NF-κB-Luc、AP1-Luc,通过测定荧光素酶的活性以确定F10基因对NF-κB和AP1转录活性的影响;提取各实验组不同时点细胞核蛋白,用电泳迁移率改变实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测AP1、NF-κB和DNA的结合活性。结果:F10基因瞬间转染A549细胞48h NF-κB-Luc和AP1-Luc荧光素酶的活性较其对照组分别下降0.3和上升2倍、AP1和NF-κB与DNA的结合活性分别上升23%和下降49%。结论:F10基因上调AP1活性、下调NF-κB的活性。

利用F10.7和MgII构建太阳极紫外辐射长时间序列

利用SOHO/SEM在1996—2008年的太阳EUV观测数据,比较和评估F10.7和MgII作为EUV代理参数的代表性,不能支持Viereck等关于Mg II是比F10.7更好的代理参数的结论.通过比较对两种参数的多种回归计算结果,确立双因子极大似然估计方法构建EUV计算模式,通过模型计算结果与SEM观测数据比较,表明该模型能够很好地重建EUV数据系列.利用该模式,构建了1978年11月以来的太阳极紫外辐射数据序列.

B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗安全性及抗肿瘤效应研究

目的:评估B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗用于C57BL/6小鼠的安全性及其诱导的抗肿瘤免疫效应。方法:应用免疫荧光、FCM检测瘤苗细胞ESAT-6-GPI的表达情况;以Western blot方法检测瘤苗细胞IL-21的表达情况;动物实验检测瘤苗体内应用的安全性;制备荷瘤鼠术后免疫模型,评价瘤苗免疫效果。结果:B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗细胞表面有靶抗原ESAT-6-GPI表达,并分泌IL-21。于C57BL/6小鼠皮下接种2×105个B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗细胞,60天内未见致瘤,但能够诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫效应。结论:B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗致瘤性明显下降,低剂量应用具有安全性,能够诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫效应。