表达新城疫病毒F48E8株血凝素-神经氨酸酶的重组鸡痘病毒的构建和鉴定

在克隆和鉴定新城疫病毒（NDV）F48E8株血凝素－神经氨酸酶（HN）基因的基础上，应用分子克隆技术将HN基因导入鸡痘病毒插入载体pFG1175－1中启动子P7．5的下游，得到携带NDV-HN基因的质粒pFGHN1175－1。将此质粒pFGHN1175－1以脂质体转染中国鸡痘病毒疫苗株282E4株感染3～4h的鸡胚成纤维细胞，采用蓝斑筛选方法纯化3次，得到稳定的重组鸡痘病毒。用NDV—HN基因特异性探针进行斑点杂交试验以及用HN基因特异性引物作PCR检测，表明NDV—HN基因已插入鸡痘病毒基因组中。以NDV－HN蛋白特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验，证实重组鸡痘病毒在感染细胞中表达了HN糖蛋白，从而成功建立了表达新城疫病毒F48E8株血凝素-神经氨酸酶的重组鸡痘病毒。

鸡新城疫标准强毒感染鹅试验

用鸡新城疫中国标准强毒F48E8及国外标准强毒Hert33、AG68人工感染鹅，可以使鹅感染发病，F48E8攻毒组发病率100％，死亡率50％（9／18）；AG68、Hert33攻毒组发病率明显低于F48E8攻毒组和JS2／98／Goose攻毒组，死亡率分别为6％（1／15）和0％（0／15）。对照组健康，且扑杀时平均体重明显高于攻毒组。实验证明：新城疫中国标准强毒株F48E8等毒株可以使鹅发病，症状和病变都与文献中所报道的鹅副粘病毒病相同。

新城疫病毒F_(48)E_8株 HN基因在杆状病毒系统中表达

目的 采用新型杆状病毒表达系统(Bac to Bac系统)在昆虫细胞Sf-9中进行新城疫病毒F48 E8株HN基因表达。方法NDV F48 E8株 HN基因插入到转座载体 pFast Bac Ⅰ,构建重组转座载体 pFast HN,转化到感受态细胞 DH10后,将目的基因转座到穿梭载体Bacmid中,经筛选获得重组Bacmid HN转染到Sf-9昆虫细胞,并进行检测。结果 表达产物经SDS-PAGE、Westem blot检测获得蛋白特异带,相对分子质量约63000。结论NDVF48E8株HN基因能通过新型杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf-9中进行表达,表达量约为细胞总蛋白的10％。

新城疫病毒中国标准强毒F_(48)E_8株融合蛋白的结构

对新城疫病毒（ＮＤＶ）中国标准强毒Ｆ４８Ｅ８株融合蛋白的结构进行了分析．该融合蛋白的前体Ｆ０由５５３个氨基酸组成，在第１１６和１１７位氨基酸处被酶切成Ｆ１和Ｆ２亚单位．酶切激活部位序列为ＲＲＱＲＲ↓Ｆ，第１１７位氨基酸为Ｆ，具有ＮＤＶ强毒的特征．Ｆ０上有３个疏水区，其功能分别代表信号肽区、融合诱导区和跨膜结构区．Ｆ０的可糖基化部位有６个．并比较了Ｆ４８Ｅ８株和国外强毒株的氨基酸同源性，与Ｍｉｙａｄｅｒａ株、ＴｅｘａｓＧＢ株的同源性分别为９３．６４％和９２．４１％．

新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用

用RT-PCR方法扩增出新城疫病毒标准强毒株F48E8的F基因,并将其克隆到pGEM-T载体,命名为pGEM-NDF。鉴定正确后,以BamHI和XbaI双酶切将F基因从pGEM-NDF中释放出来,并插入到pFastBacI载体中,得到重组转移载体pFast-NDF。然后将该重组质粒转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中,通过转座作用获得重组穿梭质粒reBacmid-NDF。再用reBacmid-NDF转染Sf9昆虫细胞,获得含有新城疫病毒F48E8株F基因的重组杆状病毒。间接免疫荧光和Western-blot分析结果表明F蛋白在昆虫细胞中获得表达,而且主要表达于细胞膜上,并使感染重组杆状病毒的昆虫细胞在96h发生融合作用。动物试验表明,表达的F蛋白能够产生中和抗体。本文的研究结果为F蛋白的进一步开发奠定了基础。

共表达新城疫病毒F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒

应用RT PCR扩增出新城疫病毒F4 8E8株融合蛋白 (F)基因 ,将其克隆入pGEM Teasyvector构建重组质粒pGEM TF并进行测序确证。分别从pGEM T和pUCHA切下F基因和H9亚型禽流感病毒F株 (A chicken china F 1 998)血凝素 (HA)基因 ,通过一系列分子生物学操作步骤插入到质粒pFPV7S中的鸡痘病毒基因组复制非必需片段构建重组质粒p7SHF ,其中F基因和HA基因分别由鸡痘病毒启动子PE L和合成启动子PS调控。最后将P1 1 LacZ报告基因表达盒插入质粒p7SHF获得转移载体pFPVHF ,用以转染已预先感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株的鸡胚成纤维细胞 (CEF)。通过在含有X Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化重组病毒。PCR和Southernblot检测证实了F基因和HA基因已插入鸡痘病毒的基因组 ;间接免疫荧光试验结果表明重组病毒能够同时正确表达HA和F蛋白。