FAM92A1-289在不同增殖能力组织及不同周期时相细胞中的表达和意义

目的探讨基因FAM92A1-289在不同增殖能力的组织及不同周期时相细胞中的表达和意义。方法采用血清饥饿法同步化G1期He La细胞,采用胸腺嘧啶核苷双阻断法同步化S期和G2期He La细胞,采用秋水仙素阻断法同步化M期He La细胞;TRIzol一步法提取组织及细胞总RNA;实时荧光定量RT-PCR方法分别检测肝癌组织、癌旁组织、正常脑组织及He La细胞G1期、S期、G2期、M期中新基因FAM92A1-289的mRNA水平,以GAPDH为内参照。结果 FAM92A1-289基因在肝癌组织中有高表达,且肝癌组织比其癌旁组织表达升高,脑组织中表达最低;在He La细胞各周期时相中以S期表达最高,其他各期表达较低。结论 FAM92A1-289基因在增殖旺盛的肝癌组织中表达最高,且主要在细胞周期的DNA复制期表达,表明FAM92A1-289基因的表达水平与细胞增殖有关,此结果为分析FAM92A1-289功能提供了重要线索。

siRNA-FAM92A1-289对HeLa细胞增殖的影响

目的:研究RNA干扰(RNAi)沉默基因FAM92A1-289对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。方法:化学合成法合成小干扰RNA(siRNA),阳离子脂质体转染FAM92A1-289 HeLa细胞;实时定量RT-PCR检测其mRNA表达,MTT法和流式细胞仪检测转染后HeLa细胞增殖、细胞周期和凋亡变化。结果:转染合成FAM92A1-289 siRNA后,HeLa细胞中FAM92A1-289 mRNA表达下降(P<0.01),细胞增殖均明显增强(P<0.01);细胞周期分布改变,S期细胞明显增多,而G2/M期细胞减少,凋亡率无变化。结论:FAM92A1-289基因调节细胞增殖活动。

酵母双杂交技术筛选宫颈癌HeLa细胞cDNA文库中FAM92A1-289关联蛋白

目的应用酵母双杂交技术从宫颈癌He La细胞c DNA文库中筛选FAM92A1-289关联蛋白。方法构建酵母双杂交p GBKT7-FAM92A1-289诱饵载体,转化至酵母AH109感受态细胞中。利用Clontech GAL4酵母双杂交系统筛选He La细胞c DNA文库中与FAM92A1-289相互作用的蛋白质,用营养缺陷型培养基和X-a-Gal双重筛选实验进行筛选,对筛选结果进行生物信息学分析,对克隆重复率较高的蛋白进行回转验证,将β-半乳糖苷酶活性阳性的克隆进行测序并分析。结果成功构建酵母双杂交p GBKT7-FAM92A1-289诱饵载体,可在酵母细胞中正常表达FAM92A1-289,且对酵母细胞无毒性,不存在自激活现象。筛选出在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培养基及含X-a-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培养基上均能生长且β-半乳糖苷酶活性阳性的克隆9个。经生物信息学分析发现4种蛋白重复率较高,即增殖细胞核抗原(PCNA)、半乳糖凝集素1(Galectin-1)、内质网高尔基体中间室标记物53(ERGIC-53)、重组人BCL2相关永生基因1(BAG1),并均与FAM92A1-289存在相互作用。结论利用酵母双杂交技术在Hela细胞c DNA文库中成功筛选出与FAM92A1-289相互作用的蛋白,为进一步研究FAM92A1-289的功能提供了新线索。

FAM92A1-289基因的真核表达载体构建和亚细胞定位

利用PCR方法扩增FAM92A1-289全长,经BamH I和Xho I酶切后连接入pEGFP-N1真核表达载体,构建pEGFP-N1-FAM92A1-289重组表达质粒,转染Hela细胞,利用荧光显微镜观察FAM92A1-289在细胞中的定位。经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的FAM92A1-289读码框。荧光显微镜观察到空质粒pEGFP-N1转染后,整个细胞内弥散绿色荧光,而转染pEGFP-N1-FAM92A1-289重组载体后,可见绿色荧光分布于Hela细胞核中,显示FAM92A1-289定位于细胞核。成功构建人FAM92A1-289真核表达载体,FAM92A1-289定位于哺乳细胞的细胞核中。

FAM92A1-289表达的宫颈癌HeLa细胞稳转株的构建及其对细胞增殖的影响

目的构建FAM92A1-289表达的宫颈癌He La细胞稳转株,并观察其对宫颈癌细胞增殖的影响。方法构建重组载体CMV-SP6-TALEN-GFP-289,并转染至宫颈癌He La细胞。通过嘌呤霉素筛选得到稳定表达FAM92A1-289的细胞株He La/289,分别用细胞划痕实验、肿瘤球实验、MTT法检测细胞迁移能力、肿瘤生长速度、细胞存活情况。结果成功构建了超表达FAM92A1-289的宫颈癌He La细胞稳定表达株;经检测,其迁移能力更强、生长速度更快、存活率更高。结论成功构建稳定表达FAM92A1-289的细胞株He La/289;FAM92A1-289基因具有促进宫颈癌He La细胞增殖的作用,可作为细胞增殖调节相关基因。

FAM92A1-289对人脑胶质瘤U251细胞增殖、迁移能力的影响及其与Galectin-1的关系

目的探讨FAM92A1-289对人脑胶质瘤U251细胞增殖、迁移能力的影响及其与半乳糖凝集素1(Galectin-1)的关系。方法将CMV-SP6-TALEN-GFP-289质粒转染至U251细胞中,通过嘌呤霉素筛选得到稳定过表达FAM92A1-289基因的脑胶质瘤U251/289++细胞株。取脑胶质瘤U251/289++细胞作为观察组,未转染质粒的野生型U251细胞作为对照组,采用实时无标记动态细胞分析技术检测两组培养24、48、72、96、120 h的细胞增殖能力(以光密度值表示),采用Transwell小室试验检测两组细胞迁移能力(以穿膜细胞数表示)。构建PCS2-3Flag-Galectin-1质粒,将人脑胶质瘤U251细胞随机分为FAM92A1-289组、Galectin-1组、共转染组及空白对照组,FAM92A1-289组、Galectin-1组均采用Lipofactamine 3000转染法分别转染CMV-SP6-TALEN-GFP-289质粒、PCS2-3Flag-Galectin-1质粒,共转染组同时转染上述两种质粒,空白对照组仅加入Lipofactamine 3000转染试剂。采用免疫共沉淀实验验证FAM92A1-289与Galectin-1是否存在相互作用。结果两组培养24 h光密度值比较差异无统计学意义(P>0.05);观察组培养48、72、96、120 h光密度值均高于对照组(P<0.05或<0.01)。观察组与对照组穿膜细胞数分别为(242.0±11.41)、(65.40±7.92)个,两组比较P<0.01。共转染组抗GFP蛋白相对表达量明显高于FAM92A1-289组、Galectin-1组及空白对照组(P均<0.01)。结论过表达FAM92A1-289可提高人脑胶质瘤U251细胞增殖和迁移能力;FAM92A1-289与Galectin-1之间的相互作用可能为FAM92A1-289调控人脑胶质瘤U251细胞恶性行为的作用机制。

新基因FAM92A1-289与增殖细胞核抗原PCNA相互作用的验证

目的利用免疫共沉淀技术验证未知蛋白FAM92A1-289和PCNA(增殖细胞核抗原)之间的相互作用。方法构建带有嘌呤霉素抗性的载体CMV-SP6--GFP-FAM92A1-289和真核表达载体PCDNA3.1-PCNA,先将CMV-SP6-GFP-FAM92A1-289载体转染入Hela细胞,通过最合适浓度的嘌呤霉素筛选,得到稳定表达FAM92A1-289的Hela/FAM92A1-289细胞,再将载体PCDNA3.1-PCNA转染入Hela/FAM92A1-289细胞,利用免疫共沉淀来验证FAM92A1-289和PCNA之间的相互作用。结果构建的重组表达载体经双酶切、测序鉴定正确,稳定表达株Hela/FAM92A1-289细胞构建成功,PCNA单克隆抗体沉淀蛋白复合物后,用GFP抗体进行Western blot法检测,检测出了GFP-FAM92A1-289蛋白。结论免疫共沉淀证明了FAM92A1-289和PCNA之间存在相互作用。