不同基因编辑类型对FGF5基因编辑羊羊毛性状的影响

【目的】分析不同基因编辑类型对成纤维生长因子5(FGF5)基因编辑细毛羊羊毛性状的影响,为开展基因编辑细毛羊的羊毛性状遗传参数评估提供理论依据。【方法】收集181只FGF5周岁基因羊,分析编辑细毛羊羊毛自然长度、伸直长度、羊毛纤维直径和剪毛量等性状的数据。【结果】FGF5基因编辑细毛羊羊毛自然长度平均值为10.49 cm,变异系数为11.82%。FGF5-InDel和FGF5-HDR基因编辑细毛羊羊毛自然长度和剪毛量均极显著高于野生型(P<0.01)。-28 bp或-26 bp、2 bp和置换(c.61 C>T)的羊毛自然长度和伸直长度均极显著长于wt(P<0.01),-28 bp或-26 bp的剪毛量显著高于wt(P<0.05)。-28 bp基因型的双等位基因编辑和单等位基因编辑突变的羊毛自然长度和伸直长度均极显著长于野生型(P<0.01)。【结论】不同基因编辑类型的FGF5基因编辑细毛羊均可显著提高羊毛自然长度和剪毛量,可利用表型性状突出的后代组建核心编辑羊群体,促进FGF5基因编辑细毛羊选育扩繁。

滩羊FGF5、COQ9基因多态性及其与生长性状的关联分析

为探索滩羊成纤维细胞生长因子5(fibroblast growth factor, FGF5)和辅酶Q9(coenzyme Q9,COQ9)基因的多态性及其与生长性状的关联性,运用分子标记辅助育种方法,为提高滩羊的生长性状提供理论依据。针对前期研究中筛选出的位点采用SNP分型技术对107只滩羊进行FGF5和COQ9基因多态性检测,并与初生重、二毛期(35日龄)、6月龄和12月龄体重进行关联分析。结果表明,通过与绵羊参考基因组(GCF_000298735.2_Oar_v4.0)比对,在滩羊FGF5基因上筛选出2个SNPs位点,分别为g.94540629T>G和g.94540642T>C,其中g.94540629T>G位点产生TT、GT和GG共3种基因型,g.94540642T>C位点产生TT、TC和CC共3种基因型;在COQ9基因上筛选出3个SNP位点,分别为g.94503480A>G、g.24807700A>G和g.24812228T>C,其中g.94503480A>G位点产生AA、AG、GG共3种基因型,g.24807700A>G位点产生AA、AG、GG共3种基因型,g.24812228T>C位点产生TT、TC和CC共3种基因型。基因多态性分析表明,5个SNPs位点属于高度多态,且在滩羊群体处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05);关联分析结果显示,FGF5基因g.94540642T>C位点C/T基因型12月体重显著大于其他基因型(P<0.05),COQ9基因g.24807700A>G位点GG基因型12月体重显著大于其他基因型(P<0.05),g.24812228T>C位点C/C基因型12月体重显著大于其他基因型(P<0.05),由此可知,3个SNP位点对滩羊12月龄体重有显著影响;COQ9基因g.24812228T>C和g.24807700A>G位点在滩羊群体处于强连锁不平衡,FGF5基因g.94540629T>G和g.94540642T>C位点在滩羊群体处于强连锁不平衡,COQ9基因g.94503480A>G、g.24807700A>G和g.24812228T>C位点和基因型组合A/GA/AT/T与A/GA/GT/C在出生重、6月体重和12月体重显著高于其他组合基因型(P<0.05)。FGF5和COQ9基因多态性与滩羊生长性状显著相关,FGF5和COQ9基因可作为滩羊生长性状选育的候选基因,可作为滩羊体重性状的分子标记,通过常规育种结合分子标记辅助选择来提高滩羊的选育效率。

兔成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因SNP及其与产毛量的相关分析

通过PCR产物直接测序的方法,对荥经长毛兔、天府黑兔以及加利福尼亚兔的FGF5基因外显子1和外显子3进行单核苷酸多态性分析。在外显子1的217位(位点A)检测到由TCT三碱基插入引起的移码突变,在外显子3的59位(位点B)和3位(位点C)分别发生了错义突变由T→C和同义突变由T→C。通过计算发现各位点不同的基因型和等位基因频率在3个兔品种中存在较大的差异,位点A、B在长毛兔和肉兔中均有各自的优势基因型和等位基因。各位点基因型与产毛量的最小二乘分析表明,位点A各基因型的个体在产毛量上差异不显著(P>0.05),位点B各基因型个体产毛量的差异极显著(P<0.01),位点C各基因型个体产毛量的差异显著(P<0.05)。初步推断FGF5基因可能是影响长毛兔产毛量潜在的主效基因或者与主效基因连锁,可作为长毛兔产毛性状连锁分析的候选遗传标记。

不同绵羊品种FGF5基因的多态性分析

根据人和小鼠成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因的同源序列设计引物对绵羊基因组进行PCR扩增,将扩增片段进行克隆和测序,并与人和小鼠的成纤维细胞生长因子5基因序列进行同源性比较,确定扩增的片段为绵羊的FGF5基因片段。采用PCR-SSCP技术分析了FGF5基因外显子在小尾寒羊、湖羊、藏羊、中国美利奴等4个绵羊品种的多态性。结果表明:FGF5基因在P1和P2引物扩增片段中存在PCR-SSCP多态性。经克隆测序分析,位于外显子1的引物1扩增产物存在G→T突变,该突变位点使编码的氨基酸发生A→S的改变;引物2扩增产物发生了碱基序列C→T的突变,这一突变位点没有引起编码氨基酸的改变,属于同义突变。对不同绵羊品种的基因型和基因频率统计结果表明,引物1扩增产物小尾寒羊、湖羊、藏羊以等位基因A为主,而中国美利奴羊则以等位基因B为主,且各群体均处于Hardy-Weinberg平衡;引物2扩增产物小尾寒羊、湖羊、中国美利奴羊均以等位基因E为主,而藏羊的基因型频率与其它品种有显著差异,中国美利奴羊在引物2位点的基因频率处于Hardy-Weinberg不平衡状态。

山羊FGF5基因单核苷酸多态性群体遗传学分析

为了研究成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因在山羊被毛生长中的的作用,进一步寻找与山羊被毛生长相关的遗传标记,为山羊绒毛性状的标记辅助选择和育种提供一定的理论依据,根据人和小鼠成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因的同源序列设计引物对山羊基因组进行PCR扩增,将扩增片段进行克隆和测序,并与人和小鼠的成纤维细胞生长因子5基因序列进行同源性比较,确定扩增的片断为山羊的FGF5基因片断。采用PCR-SSCP技术分析了FGF5基因外显子在内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊和文登奶山羊品种的多态性,结果表明:FGF5基因在P1和P2引物扩增片段中存在PCR-SSCP多态性,而在P3和P4中没有发现多态。经克隆测序分析,位于外显子1的引物1内存在A→G突变;引物2中发生了碱基序列C→T的突变,这2个突变位点均没有引起编码氨基酸的改变,属于同义突变。对不同山羊品种的基因型和基因频率统计结果表明,引物1中内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊、文登奶山羊均以等位基因B为主,且不同群体均处于Hardy-Weinberg平衡;引物2中内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊均以等位基因E为主,而文登奶山羊的基因型频率与其他品种有显著差异;内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊在引物2位点的基因频率处于Hardy-Weinberg不平衡状态,而文登奶山羊的基因频率处于Hardy-Weinberg平衡状态。

绵羊FGF5基因的克隆、表达及RNA干扰

根据牛的成纤维细胞内生长因子5(Fibroblast growth factor 5,FGF5)基因cDNA序列设计引物,PCR扩增得到绵羊FGF5基因cDNA的开放阅读框序列,并比较和其他6种高等哺乳动物的序列同源性;同时研究该基因在绵羊多种组织的表达情况,以及研究以细胞模型RNA干扰下的表达情况。结果表明,绵羊FGF5基因ORF全长为813 bp,编码270个氨基酸,分子量约为29.58 kDa,理论等电点10.59。绵羊FGF5基因cDNA序列与牛、人、小鼠、大鼠、犬和猫的对应序列同源性高度保守,预测氨基酸序列同源性同样具有高度保守性。RT-PCR分析表明FGF5在绵羊皮肤、小肠、肾脏、心脏、肝脏、脾脏、胰脏和肺中均有表达,皮肤中表达量最高。构建该基因的原核表达载体和RNAi载体,IPTG诱导在大肠杆菌中融合表达获得55 kDa的蛋白条带,设计的RNA干扰片段能显著抑制FGF5基因的表达。文章为进一步阐明绵羊FGF5的功能尤其是在羊毛生长发育中的作用提供了理论和实验基础。

绵羊FGF5基因编码蛋白的生物信息学分析

为了应用生物信息学分析绵羊FGF5基因编码蛋白的结构与抗原表位,预测该蛋白的免疫原性。根据牛的FGF5基因cDNA保守区序列设计引物对绵羊FGF5基因cDNA进行扩增,将扩增片段进行克隆和测序,并与牛的FGF5基因序列进行同源性比较,确定扩增的片段为绵羊FGF5基因片段。利用蛋白分析专家系统(ExPASy)提供的ProtParam、SOSUI、MotifScan、SWISS-MODEL等生物信息学在线分析程序,结合TMH-MM2.0、SignalP3.0、TargetP 1.1和PSORTⅡprediction、Gene Runner和DNAMAN等生物信息学软件,分析、预测FGF5蛋白的理化性质、可溶性、翻译后修饰位点、亲(疏)水性、跨膜区、信号肽序列、蛋白细胞定位区域、二级结构、抗原表位等。结果显示该蛋白由270个氨基酸组成,分子式C1315H2085N389O378S6,分子质量单位为29.5847 ku,理论等电点为10.59,波长280 nm时的吸光度(A)值为0.864,半衰期为30 h,22个翻译后修饰位点、多个亲水性高的区域、2个跨膜区域、11个潜在抗原表位,为可溶性和分泌型蛋白,具有免疫原性,可据此制备多克隆抗体。

5个家兔群体FGF5基因的遗传多样性分析

设计5对特异性引物,采用PCR-RFLP法及PCR-SSCP法对5个家兔群体FGF5基因CDS序列进行分析。结果显示：FGF5-1A发现了2个等位基因、3种基因型,在该引物285~287位点存在TCT缺失;FGF5-3B发现了2个等位基因、2种基因型,在该引物58位点处存在T→C突变。所有的群体均处于哈代-温伯格平衡,且在所选的5个家兔群体的FGF5-1A中,A1等位基因均为优势等位基因,獭兔群体表现为中度多态,肉兔群体表现为低度多态,毛兔未检测到多态。皖系长毛兔与其他家兔群体之间分布均差异极显著（P〈0.01）,九疑山兔与海狸色獭兔之间分布差异显著（P〈0.05）。该研究为FGF5基因是否能作为家兔毛质性状选育工作的分子标记提供了一定参考。

绵羊FGF5基因Exon 3多态性对毛用性状的影响

为探寻不同细毛羊品种FGF5基因多态性及其对毛用性状的影响,采用PCR-SSCP方法对苏博美利奴羊和东北细毛羊两个群体的FGF5基因Exon 3区进行了多态性分析,并在苏博美利奴羊群体中对不同基因型个体与其毛用性状进行了差异显著性分析。结果表明:苏博美利奴羊群体FGF5基因Exon 3区存在5种基因型,分别是DD、EE、FF、DE和EF,而东北细毛羊群体只存在DD、EE和DE三种基因型;苏博美利奴羊F等位基因由CDs区c.618和c.733多态位点构成,其中c.733位点C->G突变导致E等位基因型个体氨基酸L->V变异。苏博美利奴羊群体只有FF基因型个体在产毛量指标上显著高于DD基因型个体(P<0.05)。不同毛用绵羊品种FGF5基因多态性及其与毛用性状相关性的研究可为利用FGF5基因进行毛用性状选育奠定基础。

伊拉肉兔和美系獭兔FGF5基因外显子及部分内含子多态性研究

为了探索与家兔毛质性状有关的遗传标记,为家兔分子选育提供理论依据,该研究采用PCR直接测序法,对伊拉肉兔和美系獭兔FGF5基因的外显子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的序列进行分析,结果表明:(1)FGF5基因外显子Ⅰ和Ⅲ均存在多态性,FGF5外显子Ⅱ不存在多态性;(2)FGF5基因外显子Ⅰ的A位点存在AGA插入突变(反向测序),有A_(1)A_(1)(突变型)、A_(1)A_(2)和A_(2)A_(2)(野生型)3种基因型,其中A_(1)A_(1)为美系獭兔的优势基因型,A_(2)A_(2)为伊拉肉兔的优势基因型;(3)FGF5基因外显子Ⅲ的B位点存在G-C突变,有B_(1)B_(1)(野生型)和B_(1)B_(2)2种基因型,且B_(1)B_(1)为这两种家兔的优势基因型;(4)应用适合性检验FGF5基因外显子ⅠA位点和外显子ⅢB位点基因型频率,发现只有伊拉肉兔群体中外显子ⅠA位点的基因型分布不符合Hardy-Weinberg平衡定律(P<0.05),而外显子ⅠA位点基因型在美系獭兔群体中和外显子ⅢB位点基因型在这两种家兔群体中的分布均符合hardy-weinberg平衡定律(P>0.05);(5)在伊拉肉兔和美系獭兔外显子Ⅰ的A位点和伊拉肉兔外显子Ⅲ的B位点均存在中度多态(0.25<PIC<0.5),美系獭兔外显子Ⅲ的B位点存在低度多态(PIC<0.25)。研究结果显示FGF5可作为影响家兔毛绒品质的候选基因,对繁育优良的皮用家兔品种具有重要意义。

CRISPR/Cas9介导的MSTN/FGF5基因编辑陕北白绒山羊粪便菌群分析

为了从绒山羊粪便微生物群落变化的角度对MSTN/FGF5基因编辑陕北白羊绒山的自身健康和环境安全性进行研究,利用6种不同培养基分别对MSTN/FGF5基因编辑和野生型陕北白绒山羊粪便中的微生物进行培养、计数,并做菌群结构的显著性检验分析。结果表明:FGF5/MSTN基因编辑和野生型陕北白绒山羊F0代和F1代公羊和母羊新鲜粪样经LB琼脂、伊红美蓝琼脂、TPY琼脂、胆硫乳琼脂、肠球菌琼脂和甘露醇盐琼脂培养后微生物计数分别为,F0代:公羊6.35±0.68,5.89±0.25;5.32±0.10,5.27±0.34;6.64±0.57,6.71±0.35;5.03±0.53,5.32±0.14;4.12±0.13,4.15±0.21;5.34±0.18,5.25±0.25;母羊6.62±0.45,6.64±0.31;4.80±0.51,4.75±0.45;7.20±0.30,7.15±0.55;4.30±0.52,4.42±0.62;5.83±0.51,5.73±0.86;6.24±0.28,6.24±0.21。F1代:公羊6.92±0.12,7.08±0.04;4.02±0.64,3.99±0.51;6.32±0.15,6.25±0.30;5.21±0.28,5.17±0.20;3.66±0.50,3.88±0.67;4.06±0.50,3.97±0.46;母羊7.12±0.24,6.96±0.19;4.15±0.19,4.25±0.24;6.45±0.30,6.56±0.45;4.97±0.42,4.87±0.38;4.04±0.96,3.96±0.57;4.10±0.28,3.85±0.37。F0和F1代MSTN/FGF5基因编辑陕北白绒山羊与野生型陕北白绒山羊粪便中菌群结构之间不存在显著性差异(P>0.05)。本研究为FGF5/MSTN基因编辑陕北白绒山羊的安全性评价研究提供了试验数据和研究基础。

水貂FGF5基因多态性及其与毛长性状的关联分析

本研究旨在检测水貂成纤维细胞生长因子5(fibroblast growth factor 5,FGF5)基因多态性,解析该基因变异位点与水貂毛长性状的相关性。首先对30只美国短毛黑水貂的FGF5基因部分序列进行了扩增和测序;使用DNAMAN软件分析发现,FGF5基因内含子1中T376C位点存在多态性位点;通过在线酶切软件NEBcutter V2.0分析表明,Taq I内切酶可用于该SNP位点基因分型。以美国短毛黑水貂和丹麦咖啡水貂共计252个血液样本的基因组DNA作为模板,采用PCR-RFLP技术对252只美国短毛黑水貂和丹麦咖啡水貂FGF5基因T376C位点进行了基因分型,并将该位点与水貂毛长性状进行关联分析。结果表明:PCR扩增片段在376位点存在突变,该位点存在2个等位基因T和C,形成TT、TC和CC 3种基因型,该变异位点在美国短毛黑水貂群体中为中度多态(0.25<PIC<0.05),而在丹麦咖啡水貂群体中表现为高度多态(PIC>0.25);χ^2检验结果显示,T376C位点在美国短毛黑水貂群体处于Hardy-Weinberg平衡状态,在丹麦咖啡水貂群体显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态;关联分析表明,FGF5基因T376C位点与水貂毛长性状极显著相关(P<0.0001)。研究结果提示,FGF5基因T376C位点可能是影响水貂毛长性状的主控位点,可作为水貂毛长性状潜在的分子遗传标记。

太行黑山羊FGF5基因CDs区的序列特征及其表达规律研究

【目的】克隆太行黑山羊成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因CDs区,并对其进行序列特征分析和实时荧光定量表达检测。【方法】于2009年的7～10月份采集太行黑山羊的皮肤组织样品,利用RT-PCR方法克隆FGF5基因CDs区序列,并分析其序列特征及在不同生长发育时期的表达情况。【结果】太行黑山羊FGF5基因CDs区全序列长度为813bp,编码270个氨基酸,其中包含一个FGF结构域(87～221位氨基酸);太行黑山羊FGF5基因CDs区核苷酸序列与牛、马、人、猩猩和小鼠的同源性分别为98%,92%,90%,90%和86%,其编码氨基酸序列与牛、马、人、猩猩和小鼠的同源性分别为98%,91%,91%,91%和91%;实时荧光定量分析结果表明,在检测的4个月份的皮肤组织中,FGF5基因在9月份表达量显著高于7、8、10月份(P<0.05),而7、8、10月份之间表达量无显著差异(P>0.05)。【结论】太行黑山羊的FGF5基因编码的氨基酸高度保守;太行黑山羊毛囊发育在7、8月份处于生长期,9月份由生长期向退行期过渡,10月份进入退行期。

5个家兔群体FGF5基因部分外显子1的遗传多样性分析

本研究设计了1对特异性引物,采用PCR-RFLP法对5个家兔群体FGF5基因部分外显子1的序列进行分析,结果显示:FGF5基因外显子1发现了2个等位基因、3种基因型,220-222位点存在TCT缺失。所有的群体均处于哈代-温伯格平衡,且在所选的5个家兔群体的FGF5基因外显子1中,A1等位基因均为优势等位基因,獭兔群体表现为中度多态,肉兔群体表现为低度多态,毛兔未检测到多态。皖系长毛兔与其他家兔群体之间分布差异极显著(P<0.01),九疑山兔与有色獭兔之间分布差异显著(P<0.05),其他群体间不存在分布差异(P>0.05)。

敲除FGF5基因对陕北白绒山羊血液生理生化指标的影响

为探究敲除FGF5基因对陕北白绒山羊血液生理生化指标的影响,本实验以敲除FGF5基因的陕北白绒山羊(公、母羊各8只,阳性)、同龄普通陕北白绒山羊(公、母羊各5只,阴性)为研究对象,分别在10月龄、1岁与1.5岁时测定8项血常规指标和14项血液生化指标。结果表明:血常规指标中,10月龄、1岁时,阳性公羊的红细胞压积(HCT)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)显著低于阴性公羊(P<0.05),阳性母羊的红细胞分布宽度变异系数(RDW)、血红蛋白(HGB)、HCT极显著高于阴性母羊(P<0.01);1岁时,阳性公羊和母羊的红细胞数目(RBC)均显著高于阴性公羊和母羊(P<0.05);1.5岁时,阳性母羊的白细胞数目(WBC)显著高于阴性母羊(P<0.05)。血液生化指标中,10月龄时,阳性母羊的球蛋白极显著低于阴性母羊(P<0.01);1岁、1.5岁时,阳性母羊的白蛋白极显著高于阴性母羊(P<0.01);1.5岁时,阳性母羊的尿素极显著低于阴性母羊(P<0.01);其余指标均差异不显著(P>0.05)。因所有指标均在参考范围内,说明敲除FGF5基因的陕北白绒山羊的蛋白质代谢、糖代谢、脂类代谢、肝胆功能、钙磷代谢均无显著影响。表明采用CRISPR/Cas9技术敲除FGF5基因并未对陕北白绒山羊的健康产生影响,但部分存在显著差异的血液生理生化指标有待进一步研究。

CYP17A1联合FGF5基因多态性与高血压的相关性评价

目的探讨CYP17A1基因C/T及FGF5 T/A多态性与原发性高血压(EH)关系。方法选取原发性高血压患者191例和健康体检者196例。应用TaqMan探针分析CYP17A1基因C/T和FGF5 T/A多态性的基因型,并探讨其相关性。结果经χ^(2)检验CYP17A1基因两组间基因型分布差异有统计学意义(χ^(2)=8.963,P<0.05),两组间等位基因频率分布差异有统计学意义(χ^(2)=9.913,P<0.05)。而FGF5 T/A多态性的基因型以及等位基因在两组中比较未见明显差异。多元回归分析中提示年龄、FGF5 TT基因型、CYP17A1 TT基因型和空腹血糖高于正常标准的人群具有更高的患病风险。空腹高血糖组较对照组患病风险提高4倍,且发现EH组血糖、甘油三酯、年龄及体重指数明显高于对照组。结论CYP17A1基因C/T基因多态性与原发性高血压发病可能相关,其中TT基因型及T等位基因的个体患高血压的风险升高。获得性因素对高血压的发病有明显的影响。

FGF5基因编辑细毛羊的健康状况评估

动物的健康状况是转基因动物生物安全评价的重要内容之一,而动物的生长发育和生理指标是评估其健康状况的有效手段。课题组前期利用CRISPR/Cas9技术获得了一批成纤维生长因子5(Fibroblast growth factor 5,FGF5)基因功能缺失的中国美利奴细毛羊。为了评估FGF5基因编辑细毛羊的健康状况和生物安全性,本试验对FGF5基因编辑细毛羊与野生型对照羊群体的生长发育性状、血液生理生化指标以及肠道微生物群落结构进行了比较和分析。结果显示:(1)FGF5基因编辑羔羊的0、2、4、6、8月龄的体重、体高、胸围、斜体长与同龄野生型细毛羊无显著差异(P>0.05);(2)不论是羔羊时期还是成年时期,FGF5基因编辑羊的红细胞、白细胞、血小板等15项血常规指标和肾功能、肝功能、醣类代谢、电解质等10项血清生化指标与野生型对照羊相比,二者均无显著差异(P>0.05);(3)利用16S rDNA微生物群落测序技术分析FGF5基因编辑羊与野生型对照羊肠道微生物群落结构。结果显示,在门水平分布中拥有共享优势菌比例达96.2%;α多样性指数差异分析结果显示,二者无显著差异(P>0.05);基因编辑羊与野生型对照羊的PCA图均可以看到明显的聚类;LEfSe分析显示,基因编辑羊有2个生物标记,野生型对照羊有2个生物标记,均为反刍动物肠道内常见菌群。研究表明,FGF5基因功能的缺失未对细毛羊的自身健康造成不利影响。研究结果为FGF5基因编辑细毛羊生物安全评价奠定了基础。

和田羊FGF5基因RNA干扰载体构建及筛选

试验旨在构建并筛选出高效的和田羊成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因的RNA干扰载体,根据和田羊FGF5基因序列,设计4条短发夹RNA(shRNA)干扰片段和1条阴性对照片段。扩增后克隆至pGPU6载体,获得4个重组质粒pGPU6-shRNA-FGF1、pGPU6-shRNA-FGF2、pGPU6-shRNA-FGF3、pGPU6-shRNAFGF4和阴性对照质粒pGPU6-shRNA-FGF5。通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序对质粒进行酶切鉴定和测序鉴定。鉴定后的质粒通过电刺激法转染至和田羊成纤维细胞,通过qRT-PCR和Western Blotting(WB)分析FGF5基因的表达情况。结果显示,与阴性载体相比,4个RNA干扰表达载体均可显著降低FGF5 mRNA和蛋白的表达量(P<0.05),其中pGPU6-shRNA-FGF3干扰效率最高,为85.20%。研究表明,FGF5干扰表达载体构建成功并可有效干扰和田羊FGF5基因表达。

BSA对FGF5基因编辑绵羊精液冷冻的效果分析

为了探讨在常规精液冷冻保护剂中添加不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)对FGF5基因编辑绵羊精液冷冻的效果。用人工采精法进行精液采集,在常规的精液冷冻保护剂中分别添加浓度为0.2%、0.5%、1%的牛血清白蛋白(BSA),以不添加BSA的常规精液冷冻保护剂作为对照,利用液氮熏蒸法对精液进行冷冻,对解冻后精子的活率、活力、顶体完整性和膜完整性进行评价,筛选BSA最佳保护浓度。浓度为0.5%的BSA在精液冷冻-解冻后,精子的活率、活力、顶体完整率各项指标能显著高于对照组(0%)和其他浓度(0.2%、1%)(P<0.05),精子的畸形率显著低于对照组和实验组(P<0.05)。浓度为0.5%的BSA在FGF5基因编辑绵羊精液冷冻中保护效果最佳,精子的各项指标得到一定的改善。本研究为FGF5基因编辑绵羊及相关品种公羊精子的冷冻保存提供了一种新的途径和有益的参考。

TALENs编辑绵羊成纤维细胞FGF 5基因

类转录激活因子效应物(Transcription activator-like effector,TALE)已经成为基因组编辑和基因转录调控的有效工具,在多个物种的基因组中实现特定位点的删除、插入和突变。针对绵羊成纤维细胞生长因子5(Fibroblast growth factor 5,FGF5)基因起始密码子ATG位点,设计构建TALENs(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs)。通过比较分析正常培养和基因组编辑处理的绵羊成纤维细胞,电转TALENs组合,Surveyor突变检测,筛选获得1对有效的TALENs。有限稀释细胞传代培养,PCR扩增FGF5基因片段,经PAGE检测筛选发生突变的细胞,测序确认FGF5基因ATG位点产生缺失突变细胞。获得具有编辑活性的TALENs,为该基因的定点编辑奠定基础。Surveyor检测和测序结果表明,在绵羊FGF5基因ATG起始密码子上游104碱基位点,存在1个G/C单核苷酸多态。