慢病毒介导的shRNA敲低FHL1的表达促进HeLa和HepG2细胞生长

目的通过构建靶向四个半LIM结构域蛋白1（FHLl）基因的慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA），观察FHLl表达降低对HeLa细胞和HepG2细胞生长的影响。方法构建FHLl基因的shRNA干扰病毒载体，将重组质粒转染人胚肾293T细胞，实时定量PCR（qRT-PCR）和Western blot法检测转染pLenti-H1 FHLlsh RNA对FHLl表达的抑制效果。慢病毒感染宫颈癌HeLa细胞和HepG2肝癌细胞，经2-3周嘌呤霉素筛选后得到FHLl稳定低表达的细胞，利用生长曲线实验和克隆形成实验检测FHLl基因表达降低后对细胞生长的影响，利用软琼脂实验检测对肿瘤细胞非锚定依赖性生长的影响。结果qRT-PCR和Western blot结果显示，构建的shRNA病毒载体能够明显抑制FHLl的表达；生长曲线实验和克隆形成实验显示，慢病毒介导的FHLlshRNA能够明显促进肿瘤细胞的生长；软琼脂实验结果表明，FHLl低表达能够促进肿瘤细胞的非锚定依赖性生长。结论构建的pLenti-H1 FHLl shRNA慢病毒载体可有效地抑制FHLl表达，明显促进HeLa细胞和HepG2细胞的增殖。

KISS1、KAI1和FHL1在乳腺癌组织中的表达及其与肿瘤转移的关系

目的研究转移抑制基因KISS1、KAI1和FHL1在淋巴结转移与否的乳腺癌组织中表达的差异及其与雌、孕激素受体的关系。方法应用组织芯片和免疫组织化学EnVision法检测59例乳腺癌组织和31例非癌组织中的KISS1、KAI1和FHL1表达情况及其与乳腺癌临床病理特征的关系。结果①乳腺癌中KISS1、KAI1和FHL1的表达与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。②KISS1、KAI1和FHL1表达与乳腺癌的腋窝淋巴结转移、临床分期呈负相关,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与患者年龄、肿瘤大小无关,差异无统计学意义(P>0.05)。③KAI1表达与ER、PR呈负相关(P<0.05);FHL1表达与PR呈负相关(P<0.05);差异均有统计学意义。④分析KISS1、KAI1和FHL1之间的关系可以看出:两两之间呈正相关,差异有统计学意义(P<0.01)。结论有淋巴结转移的乳腺癌患者KISS1、KAI1和FHL1的表达明显低于无淋巴结转移的乳腺癌患者。

Fhl1基因敲除对不同年龄小鼠腓肠肌肌纤维分化和自噬水平的影响

目的探索Fhl1(Four and a half LIM domains protein 1)基因敲除(Fhl1-ko)对不同年龄小鼠腓肠肌肌纤维分化和自噬水平的影响。方法以2.5月龄和8月龄的野生型和Fhl1-ko型雄性小鼠为研究对象,应用Western blotting技术检测自噬标记物P62(general transcription factor IIH subunit1), LC3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta)和Beclin1在小鼠腓肠肌中的表达情况。应用定量PCR技术检测不同类型的肌纤维在小鼠腓肠肌中的表达情况。结果与野生型2.5月龄的腓肠肌相比, Fhl1-ko小鼠腓肠肌中LC3BⅡ和Beclin 1明显增加, P62却并没有明显降低。而与野生型8月龄的腓肠肌相比, Fhl1-ko小鼠腓肠肌中LC3BⅡ明显增加, Beclin1表达水平改变没有统计学意义, P62的表达水平明显增加。在2.5月龄鼠中, Fhl1-ko可以明显降低腓肠肌中MYHⅡA, MYHⅡX型肌纤维相对表达量,明显增加MYHⅡB型肌纤维相对表达量。在8月龄鼠中, Fhl1-ko基因敲除可以明显增加腓肠肌中MYHⅠ和MYHⅡA型肌纤维相对表达量。结论 Fhl1-ko对不同年龄小鼠腓肠肌肌纤维分化和自噬水平的影响不同,提示调节自噬水平可能是FHL1基因突变和蛋白缺失所致的骨骼肌肌病的潜在治疗手段,并且针对不同年龄段的患者应采用差异化的精准治疗手段。

甲状腺乳头状癌中FHL1基因的表达及临床意义

目的研究FHL1蛋白和FHL1基因在甲状腺癌中的表达及临床意义。方法分别应用实时定量PCR、蛋白质杂交检测人甲状腺乳头状癌组织标本及结节性甲状腺肿标本中FHL1基因和蛋白的表达情况。结果实时定量PCR提示FHL1基因在结节性甲状腺肿中高表达,在甲状腺乳头状癌中低表达,相对表达量为(0.4538±0.0074),差异有统计学意义(P<0.05);蛋白质杂交提示FHL1蛋白在甲状腺乳头状癌中低表达(0.4033±0.0296),在结节性甲状腺肿中高表达(0.8021±0.0269),差异有统计学意义(P<0.05)。在PTC组中,女性FHL1的阳性表达率为41.4%,男性FHL1的阳性表达率为36.4%,有颈部淋巴结转移的FHL1阳性表达率为42.9%。结论 FHL1蛋白和FHL1基因在甲状腺乳头状癌中均低表达,提示在甲状腺乳头状癌中FHL1可能起抑制癌细胞的作用。

利用CRISPR/Cas9技术构建FHL1基因敲除的HepG2稳定细胞株及其功能鉴定

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人肝癌细胞HepG2中的四个半LIM结构域蛋白1(FHL1)基因,构建FHL1基因敲除的HepG2稳定细胞株。方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别FHL1基因第三外显子相关序列的上下游小向导RNA,构建真核重组表达质粒,测序鉴定后,将重组质粒包装慢病毒感染HepG2细胞,用嘌呤霉素抗性筛选稳定敲除FHL1基因的细胞株,用免疫印迹法鉴定HepG2细胞中FHL1基因的敲除效果,利用生长曲线实验和划痕实验检测基因敲除对细胞生长和迁移的影响。结果:筛选出敲除FHL1基因的HepG2细胞株,且FHL1基因敲除显著促进细胞的增殖和迁移。结论:利用CRISPR/Cas9技术获得了内源FHL1基因敲除细胞株,初步实验提示敲除FHL1基因可以促进肝癌细胞增殖和迁移,为后续研究FHL1在肝癌中的功能奠定了基础。

综合康复治疗幼儿还原体肌病病例报告

目的:探讨还原体肌病(RBM)的病例特点与康复治疗方法。方法:收集RBM患儿1例,分析其临床表现、实验室检查、影像学表现、肌肉病理及基因检测结果。对患儿采取综合康复治疗,治疗前后对患儿作康复评定,评估其转移能力、肌力、肌张力、关节活动度、GMFM评分等。结果:基因检测示FHL1基因c.C369G杂合突变,病例特点均符合RBM表现。经综合康复治疗后,患儿肌力、GMFM-88、Berg评分均较治疗前有所提高。结论:综合康复训练可维持RBM患儿肢体肌力及平衡能力,促进运动功能和转移能力恢复,延缓疾病进展。

FHL1基因变异致晚发型还原体肌病一家系报道

目的总结FHL1基因变异致晚发型还原体肌病的临床、肌肉病理和基因变异特点,提高临床医师对还原体肌病的认识。方法详细收集2021年12月就诊于焦作市人民医院的1个还原体肌病家系中先证者的临床、肌肉病理和磁共振成像资料,并对先证者和其儿子进行基因检测和家系验证。结果先证者为女性,59岁,临床表现主要为进行性、非对称性肢体无力和肌萎缩。先证者母亲、一姐和一弟有类似症状。先证者肌电图提示肌源性合并神经源性损害。肌肉磁共振成像提示病变主要累及大腿和小腿的后组肌群,臀大肌亦有受累。肌肉病理检查结果显示病变肌纤维内可见嗜伊红颗粒状包涵体和镶边空泡,以及肌原纤维结构紊乱和异常蛋白沉积。基因检测发现患者存在FHL1基因p.C150S杂合变异。结论晚发型还原体肌病以进行性、非对称性肢体近端肌无力为特征,部分可累及肢体远端肌肉和臀大肌。肌肉病理检查可见多种肌原纤维肌病特征性的病理改变,基因检测发现FHL1变异是确诊的重要依据。

靶向FHL1的microRNA初步筛选研究

目的构建含有FHL1基因3'-UTR区的荧光素酶报告基因载体,用以检测与其相互作用的microRNA(miRNA)。方法 PCR扩增出FHL1基因3'-UTR区片段,插入到经过改造的荧光素酶报告基因载体pcDNA 3.0中;利用Target Scan5.1软件预测可能与FHL1基因3'UTR区相互作用的miRNA,将miRNA与荧光素酶报告重组子共转染至293T细胞中,检测其荧光活性;构建针对荧光活性结果变化明显的miRNA的种子区缺失突变体,检测荧光活性。结果测序结果表明,含有FHL1基因3'-UTR区的荧光素酶报告基因载体构建正确;荧光素酶活性实验表明,与对照组相比,miR-200c、miR-146a、miR-146b-5p可使荧光素酶报告重组子的荧光素酶活性降低40%左右,并构建上述miRNA缺失突变体,miR-200c使荧光素酶活性回复。结论成功构建了FHL1基因3'UTR区的荧光素酶报告基因载体,而miR-200c、miR-146a、miR-146b-5p可以抑制其荧光素酶活性,其中miR-200c可能直接作用于FHL1基因3'-UTR区。