135位点表达ORFVF1L基因的重组山羊痘病毒的构建

【目的】采用Cre/Loxp基因编辑系统,在羊痘病毒135基因位点插入ORFV外源基因F1L,同时引入标记基因,从而构建重组山羊痘病毒,为临床上预防羊口疮疫苗的设计、研制提供参考。【方法】以pDonor载体为基础,135基因编码区两侧500 bp左右的片段作为上下重组同源臂,中间插入羊口疮病毒F1L基因编码区及标记基因gpt、EGFP、痘病毒早晚期启动子p7.5、p11,并且含有loxp位点,构建同源重组供体质粒命名为pGTPV(135)-ORFV-F1L;并对阳性克隆菌液进行PCR鉴定并测序,经测序正确的菌液接种氨苄LB液体培养基培养过夜,提取去内毒素的质粒并进行双酶切鉴定。山羊痘病毒弱毒株感染永生化山羊睾丸细胞2 h后,重组质粒经脂质体法转染永生化山羊睾丸细胞,观察细胞病变及EGFP标记基因的表达情况;48 h后收获病毒液,反复冻融后离心,盲传3代,通过PCR鉴定目标基因的整合情况,以羊口疮病毒阳性血清为一抗,驴抗山羊IgG为二抗,通过蛋白免疫印迹分析目标基因的表达情况来对获得的重组病毒进行鉴定。【结果】经PCR筛选,成功获得表达羊口疮病毒F1L基因的同源重组供体质粒。经过测序并与目标序列进行比对,结果正确,表明重组质粒成功构建。重组质粒经去内毒素提取后测定浓度并进行双酶切鉴定,结果与预期相符,经鉴定的重组质粒转染山羊睾丸细胞,在48 h后观察到细胞病变及绿色荧光,PCR鉴定结果表明F1L基因整合到重组病毒上。蛋白免疫印迹分析显示,检测到目标蛋白条带,说明重组山羊痘病毒插入的外源基因F1L基因成功表达。【结论】本研究成功构建了一种在135基因位点表达羊口疮病毒F1L基因的重组山羊痘病毒,并在永生化山羊睾丸细胞中,该重组病毒展现出目的基因的稳定表达。以羊痘病毒弱毒株135基因位点插入羊口疮病毒F1L外源基因,该重组病毒在永生化山羊睾丸细胞中获得,目的基因能稳定表达,成功构建135基因位点插入羊口疮病毒F1L基因的重组山羊痘病毒方法。

羊口疮病毒重庆株F1L基因克隆与生物信息学分析

旨在分析OrfV-CQ株F1L基因的分子特点,预测其编码蛋白的生物学功能。对OrfV-CQ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,利用生物信息学相关软件进行序列分析并对其编码蛋白的二级结构、B细胞表位、T细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽进行预测。结果表明,OrfV-CQ株F1L基因长1 023bp,编码340个氨基酸,与Shanxi株F1L基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%和95.0%。OrfV-CQ株F1L基因编码蛋白的α-螺旋、β-片层、β-转角、无规则卷曲分别为11.21%、10.3%、2.73%、75.76%;可能存在5个B细胞优势抗原表位,3个CTL表位,4个Th细胞表位,无跨膜结构域和信号肽。

重庆地区羊口疮病毒的分离鉴定及F1L基因的原核表达

本试验旨在对重庆地区羊口疮病毒(ORFV)进行分离培养及鉴定,并研究其F1L基因序列在大肠杆菌中的表达情况。利用MDBK细胞对疑似ORFV感染的羔羊痂皮中的病毒进行分离培养;对F1L基因序列进行PCR扩增,引入限制性内切酶NotⅠ和EcoRⅠ,构建重组质粒pET-32a-F1L,转化至大肠杆菌BL21菌株后,对阳性菌株进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。结果表明,所获得的毒株为ORFV,其F1L基因在大肠杆菌中的表达产物大小约为57.4ku,主要以包涵体形式存在,5h为最佳诱导表达时间,并具有良好的反应原性。

羊口疮病毒榆林株B2L和F1L串联基因在昆虫杆状病毒系统的表达

【目的】克隆分析羊口疮病毒(ORFV)榆林株(ORFV-Yulin)的F1L基因序列,通过昆虫杆状病毒表达B2L和F1L串联基因。【方法】采用PCR方法扩增ORFV-Yulin株F1L全长基因,测序后对其进行序列分析和遗传进化分析。扩增ORFV-Yulin株B2L融合基因(r B2L)和F1L融合基因(c F1L),利用碱基linker连接,通过重叠PCR方法扩增获得ORFV r B2L-linker-c F1L重组基因(r B2Lc F1L),将其与昆虫杆状病毒表达载体pBac5连接构建表达载体pBac-rB2LcF1L。将pBac-rB2LcF1L包装出杆状病毒,侵染sf9细胞,通过SDS-PAGE、Western-blotting以及质谱鉴定等方法验证目的基因r B2Lc F1L的表达。【结果】克隆获得了1 029bp的F1L全长基因,该基因高度保守,与FJ-MH2015株的序列相似性最高,核苷酸和氨基酸的相似性分别为99.0%和99.4%。系统进化分析表明,ORFV-Yulin株与XP(KU199840.1)、FJ-MH2015(KM675409.1)以及Shanxi(HQ221964.1)株同处于一个分支。PCR扩增获得了855bp的c F1L基因、1 180bp的r B2L基因及1 983bp的r B2Lc F1L基因,成功构建了pBacrB2LcF1L载体,并包装出相应的杆状病毒。B2L和F1L串联基因通过昆虫杆状病毒表达系统获得成功表达,表达产物的分子质量为80ku,且有部分重组蛋白能分泌到细胞培养基中。【结论】ORFV-Yulin株的B2L和F1L串联基因在昆虫杆状病毒系统表达成功。

羊口疮病毒新疆野毒株SHZ1 B2L和F1L基因的克隆及遗传进化分析

为了研究羊口疮病毒(ORFv)新疆野毒株的遗传进化情况,参照GenBank公布的ORFv B2L和F1L基因序列,设计特异性引物,对ORFv SHZ1新疆野毒株B2L和F1L基因进行PCR扩增,克隆、测序后进行遗传进化分析。结果表明:新疆野毒株SHZ1与GenBank公布的不同地域的17个流行株相比,B2L基因核苷酸同源性为97.28%～98.86%,推导氨基酸同源性为88.65%～90.50%;F1L基因核苷酸同源性为94.56%～97.07%,推导氨基酸同源性为93.82%～95.88%。基于B2L基因的遗传进化树分析发现,SHZ1株B2L基因与我国现用疫苗株B2L基因亲缘关系较近;而基于F1L基因的遗传进化树显示,SHZ1株与意大利分离株的亲缘关系最近。本研究提示ORFv SHZ1株可能是国外流行株与疫苗株重组后产生的一个变异株。

福建省羊传染性脓疱病毒F1L、B2L和VIR基因的遗传变异分析

为探明2014年-2015年在福建省流行的羊传染性脓疱病毒(ORFV)遗传变异情况,对10株ORFV流行毒株的F1L、B2L和VIR基因进行克隆、测序及分析。结果表明,10株ORFV F1L基因之间的核苷酸序列同源性为97.6%~100%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.8%~99.7%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.3%~97.1%;同NZ2参考株比较,FJ-YT2014缺失2个氨基酸;10株ORFV B2L基因之间核苷酸序列同源性为97.5%~99.9%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.7%~99.5%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.7%~97.7%;10株ORFV VIR基因之间的核苷酸序列同源性为95.8%~99.5%,与国内株的核苷酸序列同源性为94.6%~99.6%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为94.6%~96.4%。基于基因核苷酸序列的遗传进化分析表明,10株ORFV F1L基因与福建省分离株、山西株和新疆株亲缘关系较近;10株ORFV B2L基因与新疆、山西、德国毒株亲缘关系较近;10株ORFV VIR基因与台湾、新疆株亲缘关系较近。结果提示,当前福建省流行的ORFV F1L、B2L和VIR基因尚未出现明显变异,但是其F1L、B2L和VIR基因核苷酸序列之间普遍存在异质性。

羊口疮病毒的分离与鉴定

本试验利用犊牛睾丸细胞、羔羊睾丸细胞、MDBK、BHK-21细胞对采自内蒙古赤峰的疑似羊口疮发病羊群的唇部痂皮组织进行接种传代,分离出1株病毒,通过透射电镜负染观察和PCR检测对该分离株进行鉴定。参照GenBank中羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)ORF059(F1L)基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,成功地对分离株的F1L基因进行克隆、测序,并与多株参考毒株进行了同源性比对分析,结果显示经透射电镜负染观察到典型的副痘病毒粒子,与参考毒株序列相比均具有较高的同源性,均为96%以上,结果表明该分离株为ORFV,命名为OV/nm-hd。

羊口疮病毒F1L基因真核表达质粒构建及对小鼠的免疫原性

构建羊口疮病毒F1L基因的真核表达质粒，并探讨其对小鼠的免疫原性。本试验采用PCR扩增pMD18TFIL克隆质粒的F1L基因并将其克隆至pVAX1载体中，构建真核表达质粒并转染至MDBK细胞，采用RT—PCR和间接免疫荧光检测F1L基因在MDBK细胞中的转录和表达。将构建的pVAX1-F1L、pVAX1空载体、PBS对照通过后腿肌肉注射的方式免疫KM系小鼠，通过间接ELISA、MTT和FACS法对该DNA疫苗的免疫效果进行评价。结果表明，成功构建了真核表达质粒pVAX1F1L，并能在MDBK细胞中获得较高水平的表达。免疫小鼠后诱导的特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖反应、CD4^＋、CD8^＋细胞百分比和IL-2、IFN-γ、IL-4细胞因子水平均高于pVAX1纽和PBS对照组。因此，制备的重组核酸疫苗免疫小鼠后能够诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。

羊口疮病毒上海流行株的分离鉴定及其保护性抗原基因遗传进化分析

为了解上海地区羊口疮病毒（ORFV）流行毒株的分子生物学特性与遗传变异情况，采集疑似0RFV感染的羔羊唇部结痂组织，应用PCR、MDBK细胞分离培养、电子显微镜观察、间接免疫荧光技术等方法，进行分离鉴定，并对这2个分离毒株保护性抗原基因F1L、B2L进行克隆与序列分析。结果表明，成功分离到2株ORFV，将其分别命名为ORFuF416、ORFV-F429。其中，2株分离株F1L基因与参考毒株核苷酸序列同源性分别为95．2％～99．4％，推导氨基酸序列与参考毒株氨基酸序列同源性分别为94．4％～99．4％，遗传进化树分析均显示2株均属于同一分支，且与福建株FJ—YX（KC568410）亲缘关系最近。但与相关参考毒株相比，分离株FIL基因编码的氨基酸在44～66位不存在核苷酸的缺失，表明上海流行株与FJ—YX株存在一定的变异。2株分离株B2L基因与参考毒株核苷酸序列同源性为96．7％～99．6％，氨基酸序列同源性为94．7％～98．9％，且在遗传进化树上均与广西株GX—YB（JQ904793）有较近的亲缘关系，但与中国疫苗株（JQ904789）亲缘关系较远。表明从上海地区分离得到的2个毒株与流行于中国南方地区的0RFV毒株有较近的亲缘关系，但分离株的FIL基因和B2L基因存在一定变异。