Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡实验

课程组面向本科生开设了利用Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡的实验项目。该实验加入化疗药物依托泊苷(简称VP-16)诱导Jurkat细胞发生凋亡,使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况,在荧光显微镜下拍照计数。实验结果表明:紫外光激发下,早期凋亡细胞呈现绿色荧光,而晚期凋亡细胞和坏死细胞呈现红色荧光;对细胞计数可知,对照组各时期细胞数符合正常范围,经药物处理后,各时期细胞凋亡率随药物浓度升高而升高,其中早期和晚期凋亡细胞占比最高;在高浓度药物处理后,细胞被大幅度杀伤,仅剩余几个早期凋亡细胞。实验将Annexin V-FITC/PI试剂盒与荧光显微镜结合使用,突破了教学经费、规模和仪器等条件局限,实验成本相对较低,适于大班教学,实验结果直观便捷,能够让学生深入、系统地掌握细胞凋亡的实验原理和检测方法,符合本科生实验项目的综合性高、设计性强和研究性佳的特点,切实提升细胞生物学实验课程的质量和水平。

CE法测定CD45-FITC荧光抗体溶液中的游离FITC

建立了测定CD45-FITC荧光抗体样品溶液中游离FITC浓度的毛细管电泳(CE)方法。熔融石英毛细管45 cm(有效长度30 cm)×75μm i.d.;0.05 mol·L-1磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(含5g·L-1PEG4000,p H=7.14);分离电压+12 k V;进样压力0.5 psi(3.45 k Pa),进样时间3.0 s;分离温度25℃;UV-Vis检测器检测波长200 nm。该方法能有效测定CD45-FITC荧光抗体样品溶液中游离的FITC含量,线性回归方程相关系数r=0.9900,检测限LOQ=0.20μg·m L-1。样品加标回收率为105.49%,相对标准偏差小于5.36%。该方法快速、灵敏、重现性好,能用于CD45-FITC荧光抗体样品溶液中游离FITC的快速测定。

FITC标记重组灵芝免疫调节蛋白(rLz-8)在NB4细胞中的动态定位

实验发现,重组灵芝免疫调节蛋白(rLz-8)可直接杀伤人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4.利用异硫氰酸荧光素(FITC)标记rLz-8,其相关的活性实验结果和晶体结构分析都表明,FITC没有影响rLz-8已知生物学功能.通过激光共聚焦显微镜观察FITC-rLz-8在NB4细胞内的动态过程发现,FITC-rLz-8可识别细胞膜上的受体,并可进入细胞质,并最终富集在细胞核区域内.Annexin V-FITC双染检测结果显示,rLz-8对NB4细胞杀伤作用的可能机制是对NB4细胞凋亡的诱导作用,在一定浓度范围内,剂量与凋亡诱导率成正相关.因此rLz-8能够诱导肿瘤细胞NB4发生凋亡的亚细胞学机制可定位在细胞核上.

FITC标记脂肪酶的稳定性和荧光光谱

以FITC(异硫氰基荧光素)为荧光探针,研究了标记后的脂肪酶的活性、构象、荧光光谱的变化及三者之间的联系。在不同变性条件下,比较了标记与未标记的脂肪酶活性变化及相对应的荧光光谱。结果表明,荧光标记的脂肪酶耐热性能比未标记的酶有所提高,70℃时完全失活。荧光标记的脂肪酶耐酸碱性能增强。在盐酸胍变性剂的条件下,荧光标记的脂肪酶活性下降趋势渐缓,荧光光谱能较好的反映脂肪酶的活性变化。

Annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的比较

目的比较annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的优缺点。方法用DEX诱导胸腺细胞凋亡和H2O2诱导K562细胞系细胞凋亡,应用Hoechst33342/PI和annexin V-FITC/PI双色标记流式细胞术检测体系检测细胞凋亡情况。结果 Annexin V-FITC/PI双标记法能准确地反映2种模型中的细胞凋亡情况,与其检测原理一致;而Hoechst33342/PI双标记法虽能准确反映DEX诱导胸腺细胞的凋亡情况,但在检测H2O2诱导的K562细胞凋亡时,其早期凋亡细胞的分布与其检测原理明显不符。结论与annexin-V-FITC/PI双标记法相比,Hoechst33342/PI双标记法有一定的局限性。

FITC标记的GSTP1蛋白在鼠巨噬细胞中的定位

GSTP1(GSTπ)是人体内谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的一种重要的活性亚型,属于机体内源性蛋白,不会引起免疫原反应,在维持细胞的正常机能中发挥着重要作用,也是一种具有临床应用价值的抗氧化剂.本实验室在研究中首先发现GSTP1具有明显的抗炎作用,由此我们设想可以通过增加外源性的GSTP1蛋白来提高其在机体内的水平,以此增强机体的抗炎能力.本实验将薄层色谱扫描和SDS-PAGE相结合用于FITC标记蛋白质的检测,使用激光共聚焦显微镜和流式分析相结合的方法研究了外源GSTP1蛋白在RAW264.7巨噬样细胞和鼠腹腔巨噬细胞中的跨膜转位,结果显示外源GSTP1蛋白能够进入上述细胞.该研究为GSTP1蛋白作为直接使用的药物在抗肿瘤、抗炎、抗氧化等领域的应用提供了实验基础.

FITC-BSA与FI在葡萄膜巩膜模型中分布的对比研究

目的:从形态学方面观察比较FITC-BSA(异硫氰酸荧光素牛血清白蛋白)与FI(荧光素钠)在葡萄膜巩膜途径中的分布状况,探求FITC-BSA作为示踪剂的优点与可行性。方法:10只家兔,右眼前房内注入FITC-BSA为A组(n =10),左眼注入等量的FI为B组(n =10)。分别于术后2,4,6,8,10h,各处死家兔2只,摘除双侧眼球作冰冻切片,荧光显微镜下观察睫状体、脉络膜上腔、前、后巩膜和脉络膜部位的荧光强度并确定其等级。结果:A组葡萄膜巩膜途径各部位的荧光强度均比B组增强。结论:FITC-BSA示踪法是一种较为理想的研究葡萄膜巩膜途径的方法。

拟南芥Ran2小GTP结合蛋白抗血清的制备及其FITC荧光标记

将原核表达、纯化的Ran2蛋白对新西兰兔进行免疫制备抗血清,ELISA测定其效价为1∶51 200。免疫印迹分析表明,原核表达、纯化的Ran2和拟南芥可溶性蛋白杂交带均在26 ku处。FITC荧光标记抗体检测Ran2绿色杂交带主要出现在细胞分裂间期的核膜上。

FITC-NYZL1分子探针标记膀胱癌患者尿脱落细胞特异性的研究

目的研究FITC-NYZL1分子探针标记尿脱落细胞的特异性,探索其在诊断和监测膀胱癌的临床应用价值。方法收集2014年8月至2015年1月山西医科大学第一医院66例膀胱癌患者尿液,选取12例膀胱炎患者和24名健康人作为对照。固相合成法制备探针FITC-NYZL1,将2h内的新鲜尿液离心、滴片,加入探针孵育,扫描激光共聚焦显微镜(LSCM)观察探针与细胞的结合率,同时取新鲜尿液进行瑞-吉染色。结果 FITC-NYZL1标记膀胱癌患者尿脱落细胞的阳性率为100%(66/66);不同临床分期患者尿脱落细胞的结合率有差异。对照组结合率很低,实验组与对照组间差异有统计学意义(P<0.001)。结论 FITCNYZL1分子探针标记结合膀胱癌细胞,特异性高,可提高膀胱癌患者尿脱落细胞的阳性率;FITC-NYZL1在分期不同的癌细胞中结合率不同,分期越高,荧光探针特异性结合率越高。FITC-NYZL1标记有望成为膀胱癌无创诊断和临床监测的新技术。

911-FITC荧光探针与免疫细胞的结合实验

应用911-FITC荧光探针对胸腺、脾脏淋巴细胞、巨噬细胞和内皮细胞进行了荧光染色,采用流式细胞仪及荧光显微镜对细胞的染色情况进行了评价。结果表明,911-FITC荧光探针能与淋巴细胞、巨噬细胞和内皮细胞发生特异性结合。证明911可通过与免疫细胞直接结合而起到免疫调节作用。

Annexin V-FITC/PI法检测脂多糖诱导滋养细胞的凋亡

目的:通过流式细胞术测定法检测脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对滋养细胞凋亡的影响,明确LPS与滋养细胞凋亡的关系,为预防和治疗由滋养细胞凋亡导致的病理妊娠提供新的思路。方法:利用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测不同浓度的LPS处理培养的JEG-3细胞系滋养细胞的凋亡率分析。结果:流式细胞检测结果显示LPS组凋亡指数分别为(2.05±0.33)%、(7.43±0.68)%、(13.43±0.90)%显著高于对照组(0.80±0.15)%,且P均<0.01。结论:Annexin V-FITC/PI法能特异地、准确地检出早期凋亡的细胞、继发性坏死的细胞;LPS能够诱导滋养细胞过度凋亡,且凋亡率随着LPS浓度的增加而增加。

环孢素A体外抗FITC-ConA标记的曼氏血吸虫童虫的作用

目的探讨环孢素A体外抗FITC ConA标记的曼氏血吸虫童虫的作用以及虫体表膜通透性。方法人工制备曼氏血吸虫童虫,使用FITC ConA进行标记,环孢素A体外作用,荧光显微镜下观察并摄照。结果童虫损伤或死亡,虫体逐渐从淡蓝色变成亮蓝色,虫体可见多个亮蓝色小点,虫体表面损伤。结论环孢素A能增加童虫表膜流动性。

表面等离子共振测定CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合常数

运用表面等离子共振(SPR)平台建立测定CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合常数的方法。当偶联蛋白A的传感芯片上流过CD45-FITC抗体溶液时,双通道SPR仪实时监测CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合过程,获得了该反应不同温度下的结合速率常数k_a、解离速率常数k_d和结合平衡常数K_a,以及该反应的活化能E_a和焓变△H。结果表明该特异性结合比较适宜的条件是:中性或微碱性、较高的离子强度和较高的温度。该方法操作步骤简单、快速、灵敏度高、消耗样品少,是研究分析免疫球蛋白IgG抗体和蛋白A等生物分子相互作用比较理想的方法之一。

FITC-BSA前房注入示踪法对兔眼葡萄膜巩膜途径的形态学研究

目的 :探讨兔眼葡萄膜巩膜途径 (Uveoscleraloutflow ,FU)的研究方法和从形态学方面观察兔眼FU。方法 :于前房内注入微量示踪剂异硫氰酸荧光素牛血清白蛋白 (Fluororesceinisothiocyanate -bovineserumalbumin ,FITC-BSA)后 0 .5h ,2 .5h ,4 .5h ,6 .5h ,8.5h和 10 .5h各处死家兔 2只 ,摘除双侧眼球作冰冻切片 ,于荧光显微镜下观察并确定睫状体、脉络膜上腔、前、后巩膜和脉络膜的荧光强度等级。结果 :睫状体和脉络膜上腔的荧光强度最强 ,前巩膜次之 ,后巩膜和脉络膜最弱。结论 :FITC -BSA前房注入示踪法是一种从形态学方面研究FU的有效方法 ,在兔眼FU以前巩膜途径为主。

兔眼葡萄膜巩膜引流术后FITC-Dextran在眼组织中的分布

目的观察兔眼葡萄膜巩膜引流术后房水流出道的形态学改变。方法 20只中国白兔随机分为2组,一组行葡萄膜巩膜引流术,另一组行小梁切除术,均行右眼手术。术后2周术眼前房内灌注异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC-Dextran),处死后取完整眼球做冰冻切片,在激光共聚焦显微镜下观察荧光素的分布。与手术部位处在眼环同一子午线上的同眼的对称部位未手术眼组织作为对照。结果在葡萄膜巩膜引流术组,荧光素的分布在前、中部巩膜最强,前葡萄膜次之;而在小梁切除术组,荧光素的分布在前葡萄膜最强,前、中部巩膜次之,两组的后葡萄膜和后巩膜均有部分中等亮度的显影,对照组的后葡萄膜和后巩膜则几乎无显影,且两组的前、中部巩膜荧光素强度均明显高于对照组。结论葡萄膜巩膜引流术和小梁切除术术后房水引流均是多途径的,既有外滤过,还增强了葡萄膜巩膜引流。与小梁切除术相比,葡萄膜巩膜引流术还明显增加了跨巩膜引流。

一种高效FITC标记LPS方法的建立及应用

目的探索一种高效的荧光素示踪内毒素(lipopolysaccharide,LPS)的方法。方法将LPS解聚为单体后,加入表面活性剂,在37℃中性溶液中用FITC标记LPS18h,通过分子截留技术将小分子游离的FITC及其他杂质从FITC-LPS中除去,并用荧光分光光度计分别测定标记反应液和纯化后的FITC-LPS溶液的荧光值,将两者进行比较,测定荧光标记率。结果本方法标记的FITC-LPS在激光共聚焦显微镜下能进行良好示踪。经荧光分光光度计检测其标记率为LPS∶FITC=1∶33.13(物质的量比值)。结论利用表面活性剂与超滤纯化相结合对LPS进行FITC标记的方法较传统方法效率高,操作简单可靠,为医药学实验中示踪LPS提供了一条有效的途径。