FLAG标签纳米抗体的筛选、表达及验证

纳米抗体是一种新型的蛋白质工程抗体,其体积小、稳定性强、亲和力高等特性为科学研究提供了新的可能性。FLAG标签是一种广泛应用于生物学研究中的短肽标签,在生物学研究中具有重要的作用。为了制备FLAG标签的纳米抗体,利用酵母双杂交技术筛选出具有高亲和力的纳米抗体,并对制备的FLAG纳米抗体进行性能检验。通过DNA重组技术,构建包含FLAG的诱饵载体,利用酵母双杂交技术,在驼源纳米抗体酵母文库中,筛选针对FLAG标签纳米抗体。在酵母文库中筛选出5个单一的候选抗体DNA序列,为了排除载体本身表达蛋白序列对抗体筛选带来的干扰,通过“点对点”验证方法排除非特异性杂交的可能,通过该操作确认所筛选的5株纳米抗体均能与FLAG标签发生特异性亲和反应。为了制备纳米抗体,构建了5个纳米抗体原核表达载体,并利用大肠杆菌体系进行表达。通过SDS-PAGE和Western杂交(WB)分析,结果显示,成功获得2株可溶性表达的抗FLAG标签蛋白纳米抗体。对这2株纳米抗体与商品化的常规FLAG标签抗体进行效果比对,结果显示制备的2株纳米抗体与商品化抗体均能够识别FLAG多肽及含有FLAG标签的融合蛋白,且在特异性上没有明显区别,表明制备的FLAG纳米抗体具有较好的应用前景。基于酵母双杂交技术,成功筛选并制备了FLAG标签纳米抗体,这一成果不仅丰富了纳米抗体的类型,也为抗体开发及应用提供了新的途径。该研究为进一步研究FLAG标签在生物学研究中的应用,以及纳米抗体在生物工程中的应用提供有力支持。

SYSMEX XN-350血液分析仪检测儿童全血样本白细胞分类和Q-Flag标识准确性评估

目的评估sysmex XN-350血液分析仪白细胞分类和Q-Flag标识在儿童全血标本检测中的准确性。方法收集2020年10月~2021年3月华中科技大学同济医学院附属同济医院124例0~12岁儿童静脉抗凝全血样本,分别进行仪器检测和涂片染色人工镜检分类。对XN-350白细胞分类及Q-Flag标识结果与镜检结果进行比较分析,评价仪器的准确性。结果两种方法的中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞相关系数分别为0.992,0.986,0.893,0.798和0.754(均P<0.001)。仪器各Q-Flag标识特异度较好(均>90%);除Left Shift(90.91%)较高外,其余参数敏感度较低。Left Shift,PLT Clump,NRBC,Aty Lymph和Blast/Abn Lymph的阴性预测值较好(均>85%)。Aty Lymph,PLT Clump和Blast/Abn Lymph的阳性预测值相对较佳,分别为79.41%,80.00%和75.33%。结论应用XN-350血液分析仪检测儿童样本时,白细胞分类结果可靠,是儿科门急诊首选的小型血液分析仪。而仪器Q-Flag的假阳性率较高,需对标识报警的样本进行必要的人工复检。

C端带Flag标签重组小鼠IL-33慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建C端携带Flag标签蛋白的重组小鼠IL-33慢病毒表达载体,为进一步研究IL-33在肿瘤免疫中的作用提供实验基础。方法设计引物在小鼠IL-33基因的C端加入Flag标签,PCR法扩增带有标签的目的基因,再接入经酶切后的线性化pLVX-puro慢病毒载体。带标签的目的基因重组载体用两种限制性内切酶ApaI和XhoI酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳鉴定,最后测定目的基因序列。结果成功构建重组小鼠IL-33慢病毒表达载体并将Flag标签成功插入到目的基因的C端。结论成功构建了重组慢病毒表达载体pLVX-mIL-33-Flag,为下一步在肿瘤中研究IL-33的作用和机制奠定了基础。

XN1000-B4全自动血液分析仪Q-Flag报警在判断血小板聚集中的应用

目的根据XN1000-B4全自动血液分析仪中“PLT Clumps”的Q-Flag报警值判断低值血小板(PLT)结果的可靠性。方法通过对XN1000-B4全自动血液分析仪分析的低值PLT标本进行人工推片镜检,积累标本的Q-Flag报警值的分布及对应的PLT聚集情况,进行灵敏度和特异度分析并绘制ROC曲线。结果200份PLT聚集阳性标本的Q-Flag报警值分布于20~300之间。收集400份Q-Flag报警值>20的低值PLT标本进行人工推片镜检,结果显示,不同Q-Flag报警值分组的PLT聚集情况(阴性、阳性)比较,差异有统计学意义(χ^(2)=97.547,P=0.000);且随着Q-Flag报警值的增高,PLT聚集的阳性率增高,趋势性χ^(2)检验显示差异有统计学意义(趋势性χ^(2)=0.494,P=0.000);当Q-Flag报警值≥250时,PLT聚集阳性的灵敏度为95.0%。收集Q-Flag报警值<30的200份低值PLT标本进行人工推片镜检,结果显示,Q-Flag报警值<20时标本未发生PLT聚集的特异度为100.0%。ROC曲线提示,以Q-Flag报警值预测PLT聚集情况的最佳临界值为100,此时曲线下面积为0.900,灵敏度为86.5%,特异度为75.6%。结论通过XN1000-B4全自动血液分析仪“PLT Clumps”的Q-Flag报警值判断低值PLT标本是否发生PLT聚集具有较高的可行性,其应用不仅利于检验工作者提高工作效率,而且更好地保证了检验质量。

RANDERS SPACES WITH SCALAR FLAG CURVATURE

Let(M, F) be an n-dimensional Randers space with scalar flag curvature. In this paper, we will introduce the definition of a weak Einstein manifold. We can prove that if(M, F) is a weak Einstein manifold, then the flag curvature is constant.

东芝进一步扩展Thermoflagger产品线

东芝电子元件及存储装置株式会社(东芝)宣布,进一步扩展Thermoflagger过温检测IC产品线---“TCTH0xxxE系列”。该系列可用于具有正温度系数(PTC)热敏电阻的简单电路中,用来检测电子设备中的温度升高,六款新产品于今日开始支持批量出货。当配置在具有PTC热敏电阻(其电阻值随温度变化而变化)的简单电路中时,Thermoflagger过温检测IC不仅可以检测温度升高,还可以检测置于热源附近的PTC热敏电阻的电阻变化,并在温度过高时输出FLAG信号。例如,当Thermoflagger检测到异常发热情况并向MCU发送FLAG信号时,MCU将关闭设备或改变正在产热的设备或半导体的运行方式。通过串联PTC热敏电阻可同时在多个点进行过温检测。

一种具有flag板的自动化轨道吊大车定位装置及其应用探究

目前自动化轨道吊堆场在使用期间会出现沉降或者凸起现象,轨道吊在大车行进期间会造成大车对射开关无法感应到flag板以及大车对射开关支架与flag板碰撞损坏的情况,通过安装可调式的flag板,可在堆场实际沉降或者凸起的地方对flag板进行高度的改变,以满足自动化轨道吊大车行走机构精准定位以及行进时实时位置校验,提高自动化轨道吊的作业效率。

FLAG方案治疗难治复发急性髓系白血病的临床研究

目的:通过回顾性分析FLAG治疗方案对初治诱导失败和难治复发急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者的疗效及患者预后,探讨患者的治疗选择及治疗时机。方法:对2006年7月至2013年7月住院治疗的38名初治诱导失效及难治/反复AML患者进行了回顾性分析。38例患者的中位年龄40.5(13-69)岁,根据疾病状态分为初次诱导失败组、再次诱导失败组、早期复发组、晚期复发组;根据危险分层分为预后良好、预后中等和预后不良组。结果:22例达CR(complete remission),5例达PR(partial remission),CR率为57.9%,总有效率OR(overall response)为71.1%。初次诱导失败组的CR率(12/16,75%)高于再次诱导失败组(3/7,42.9%)和晚期复发组(6/12,50%),预后较好组和预后中等组的CR率(5/8,62.5%,16/26,61.5%)高于预后不良组(1/4,25%)。危险分层与CR有关(P=0.03)[OR 25.9,(95%CI 1.2-545.4)],预后中等是CR的有利因素。在22例CR患者中,12例行造血干细胞移植,其中6例存活,另10例以大剂量阿糖胞苷和其它方案进行巩固治疗。总生存期为25月。单因素分析FLAG方案治疗反应与生存相关[HR=0.246,CR vs NR(95%CI 0.07-0.79)],(P=0.03),CR组和PR组2年累积生存率分别为62%和48%。预后良好、预后中等和预后不良组18个月累积生存率为73%、52%和36%(P=0.17);初次诱导失败组和再次诱导失败组18月累积生存率分别为65%和32%(P=0.19)。结论:FLAG方案治疗难治复发AML患者疗效确切,通过化疗获得缓解的患者可进一步采用造血干细胞移植或其它方案以巩固化疗效果和延长生存。

FLAG方案治疗难治/复发急性髓细胞性白血病的疗效观察

为了探讨FLAG方案治疗难治和复发急性髓细胞性白血病(refractoryandrelapsedacutemyeloidleukemia)的疗效,本研究采用FLAG方案(氟达拉宾50mg,静脉点滴,30分滴完,第1-5天;阿糖胞苷1000mg/m2,静脉点滴,第1-5天;GCSF150-300μg皮下注射第0-5天)治疗27例难治和复发急性髓细胞性白血病,其中难治性AML10例,复发AML17例。结果表明:27例患者中,13例难治和复发AML达完全缓解(CR率48.2%),4例达部分缓解(PR率14.8%),总有效率63.0%。CR的患者中有3例已行异基因造血干细胞移植,目前3例均处于无病存活状况,其中存活最长的20个月,仍处于CR期。毒副作用主要为骨髓抑制、消化道症状、轻度肝功异常。结论:FLAG方案对部分难治和复发AML仍有效,毒副作用可以耐受,可用于治疗对其他化疗方案无效的难治和复发AML,并为患者行造血干细胞移植创造机会。

IDA-FLAG方案治疗复发难治的急性白血病

本研究探讨去甲氧柔红霉素(IDA)联合FLAG方案应用于复发难治急性白血病(AL)的疗效和不良反应。IDA+FLAG方案具体为:IDA10-12mg/(m2.d),第1-3天,氟达拉滨(Flu)30mg/(m2.d)(50mg/d),第1-5天,静脉滴注;阿糖胞苷(Ara-C)2000mg/(m2.d),第1-5天;粒细胞集落刺激因子(G-CSF)300μg/d,皮下注射,第0-5天。4例AL患者,男性,年龄32-44岁,其中急性髓细胞白血病(AML)3例,急性淋巴细胞白血病(ALL)1例,均为中大剂量阿糖胞苷巩固后复发或FLAG诱导无效。结果显示:4例接受IDA+FLAG治疗方案1个疗程后均达到完全缓解(CR)。1例进行异基因外周血干细胞移植(allo-PBSCT)后4个月后发生血栓性血小板减少性紫癜死亡,1例缓解后10个月再次复发,2例持续CR时间为3和4个月。化疗的不良反应主要有骨髓抑制和粒细胞缺乏所致的感染,未见心脏毒性反应及其它严重的非造血系统不良反应。结论:IDA联合FLAG治疗复发难治的AL有一定疗效,尤其对于接受中大剂量Ara-C为主的方案后而复发或无效的AL患者有较高的CR率;此外,患者对此治疗方案的毒副作用可以耐受,这为进一步治疗创造时机。

FLAG方案治疗初次诱导失败的急性髓系白血病的疗效观察

为了探讨FLAG方案治疗初次诱导失败的急性髓系白血病的疗效,本研究采用FLAG方案(氟达拉宾50mg,静脉点滴,30分滴完,第1-5天;阿糖胞苷1000mg/m2,静脉点滴,第1-5天;G-CSF300μg皮下注射第0-5天)治疗19例初次诱导失败的急性髓系白血病。结果表明:19例患者中,13例达完全缓解(CR率68.4%),2例达部分缓解(PR率10.5%),总有效率78.9%。CR的患者中有5例已行异基因造血干细胞移植,目前3例均无病存活,其中存活最长的为26个月,仍处于CR期。该治疗方案毒副作用主要为骨髓抑制、中性粒细胞减少、消化道症状、轻度肝功能异常。结论:FLAG方案对初次诱导失败的急性髓系白血病疗效好,患者对毒副作用可以耐受。因此,对于初次诱导失败的急性髓系白血病患者应该及早应用FLAG方案,为患者行造血干细胞移植创造条件。

FLAG联合改良BUCY预处理方案的异基因造血干细胞移植治疗难治复发恶性血液病疗效分析

本研究旨在观察应用FLAG联合改良的BUCY预处理方案行异基因造血干细胞移植治疗难治复发或高危恶性血液病的疗效。对10例难治复发或高危恶性血液病患者自愿接受FLAG联合改良的BUCY预处理的异基因造血干细胞移植的疗效进行分析。10例中复发2例(早期复发1例,淋巴瘤进展1例),难治7例(2例CR2,1例CR3,2例PR,2例NR),1例CR1但为高危病例。10例患者中包括急性髓性白血病8例(M11例,M25例,M61例,恶性骨髓增生异常综合征伴骨髓纤维化1例),前T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病1例,脾边缘带淋巴瘤IVB1例。结果表明,10例全部顺利植入,10例患者除2例死亡(1例死于肺部感染,1例死于真菌肺炎、渗漏综合征、多脏器功能衰竭),其余8例无复发,中位生存时间为164天(57-442天)。结论:应用FLAG联合改良的BUCY预处理方案(清肿瘤性方案)的异基因造血干细胞移植治疗难治复发或高危的恶性血液病可取得良好的疗效。

改良FLAG方案治疗33例难治复发性急性白血病的初步分析

背景与目的:FLAG方案用于治疗难治复发性急性非淋巴细胞性白血病(acutenon-lymphocyticleukemia,ANLL)已有多年,大多报道的CR率为50%～64%。本研究探讨改良FLAG方案(减少合并应用Ara-C剂量并在化疗前不用G-CSF)能否达到同样疗效,并减轻不良反应。方法:33例成人急性白血病中难治性ANLL16例,难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)12例,复发性ALL5例。全部病例接受氟达拉宾30mg·(m2·d)-1,静滴,第1～5天;其中合并Ara-C200mg·d-1有18例,Ara-C500mg·d-1有5例,Ara-C1000mg·d-1有10例,全部静脉滴注5～7天为1疗程。应用Ara-C200mg·d-1组和ALL组化疗前不用G-CSF,ALL患者每周加用长春新碱2mg,共2次;强的松60～80mg·d-1,共14天。化疗后WBC<1.0×109/L者加用G-CSF,剂量均为300μg·d-1,皮下注射至WBC3.0×109/L以上。每疗程完成后复查骨髓。结果:16例难治性ANLL的CR率为56.3%,而12例难治性ALL的CR率为8.3%(P<0.01);难治性ANLL患者中Ara-C200mg·d-1组的CR率高于500～1000mg·d-1组(70%∶33%),但无统计学差异(P>0.05)。化疗后WBC0.6×109/L和血小板15.6×109/L的平均持续时间分别为5天和4.3天,Ara-C200mg·d-1组感染发生率明显低于500～1000mg·d-1Ara-C组(58.0%∶85.7%)(P<0.05)。结论:与经典的FLAG方案相比。

FLAG方案与CAG方案治疗复发、难治性急性髓系白血病的疗效比较

目的:评价并比较FLAG方案与CAG方案治疗复发、难治性急性髓系白血病(acute myeloid leukemi-a,AML)的疗效及安全性。方法:将2004年1月至2011年3月于我院接受化疗的复发、难治性AML患者74例,按治疗方案分成FLAG组和CAG组,对2组的疗效及不良反应进行分析比较。结果:FLAG组完全缓解率(CR)为61.5%,总有效率为76.9%;CAG组CR为35.4%,总有效率为50%,组间比较差异有显著性意义(P<0.05)。原发难治AML、复发性AML、M1型、M2型、M5型及由骨髓增生异常综合征(myelody splastic syn-drome,MDS)转化而来的复发、难治性AML的CR率和总有效率,FLAG组均高于CAG组,组间比较差异有显著性意义(P均<0.05)。2组的血液学不良反应主要是骨髓抑制,非血液学不良反应较少。结论:CAG方案和FLAG方案均为复发、难治性AML的有效治疗方案,但FLAG方案CR率和总有效率高,不良反应可耐受,可进一步扩大临床应用。

使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点

【目的】筛选高效的foxp3RNA干扰的靶点用于阻断CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制功能。【方法】使用oligoengine软件设计foxp3基因shRNA序列,化学合成法合成4条shRNA序列,构建含foxp3的靶序列的慢病毒载体;构建出表达FLAG融合蛋白和目的基因的工具细胞293T细胞用于筛选RNA干扰的有效靶点。【结果】成功包装了4条foxp3基因靶序列相应的慢病毒颗粒;成功构建了表达融合蛋白和目的基因的293T工具细胞;在工具细胞上筛选出了2条RNAi效率分别为91.3%和95.6%的有效靶点。【结论】使用FLAG融合蛋白和慢病毒载体能够筛选出Foxp3基因的RNAi最佳靶点。

FLAG方案巩固强化治疗急性髓系白血病的初步研究

目的：初步探讨大剂量阿糖胞苷（Ara-C）联合氟达拉滨（Flud）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）即FLAG方案巩固强化治疗急性髓系白血病（AML）的疗效及副作用。方法：5例缓解期AML采用FLAG方案巩固治疗，即Flud 50mg／d，第1—5天；Ara-C2g／（m^2·d），第1～5天；G—CSF300μg／d，皮下注射，化疗前1天一第5天。结果：4例为持续完全缓解。1例因未再治疗5月后出现髓外复发。其中2例2疗程后成功采集足够的CD34^＋细胞并顺利进行自体造血干细胞移植。FLAG方案化疗后5例中性粒细胞（ANC）〉0．5×10^9／L的时间分别为10、7、40、12和12天，血小板（BPC）〉20×10^9／L的时间分别为13、5、42、13和10天，2例第2疗程后ANC〉0．5×10^9／L的时间分别为15和16天，BPC〉20×10^9／L的时间均为16天。而非血液学副作用不明显。结论：FLAG方案巩固强化治疗AML疗效肯定，毒副作用可耐受，且不影响造血干细胞的动员和自体造血干细胞移植。

c-flag-ago3质粒在人293细胞系中的表达及AGO3蛋白复合物的细胞定位

将c-flag-ago3质粒转入人293细胞系中,使c-flaga-go3基因稳定表达,为进一步研究AGO3蛋白复合物的结构、功能奠定了基础。利用亲和标签flag对目标蛋白进行检测和监测,将已合成的c-flag-ago3质粒和用于对照的质粒si-ago3(能使ago3基因沉默的质粒)导入人293细胞系中,在荧光镜下观察转染效果。RT-PCR法检测基因含量,蛋白印迹法(WB)检测人293细胞表达的flag-ago3,并对其蛋白复合物进行细胞定位。结果显示,c-flag-ago3质粒和si-ago3质粒成功地导入人293细胞系中,免疫细胞化学显示c-flag-ago3基因在细胞中高表达、并检测到AGO3复合物定位于细胞质中。AGO3复合物在细胞中可稳定表达,为进一步研究AGO3蛋白复合物的构成及其在人体中的功能奠定了基础。

MEA与FLAG方案治疗难治性复发性急性髓系白血病疗效及安全性分析

目的比较MEA与FLAG方案治疗难治性复发性急性髓系白血病(rr AML)的疗效及安全性,为rr AML的治疗提供依据。方法将68例rr AML患者随机分为2组,每组34例,MEA组按照米托蒽醌+依托泊苷+阿糖胞苷方案化疗;FLAG组按照氟达拉滨+阿糖胞苷+重组人粒细胞集落刺激因子方案化疗。1个疗程后评价两组化疗效果,并观察毒副反应发生情况,对两组完全缓解(CR)者采用MS-PCR、Methylight-PCR检测ID4基因甲基化水平。结果 FLAG组总缓解率高于MEA组(P<0.05);FLAG组侵袭性真菌病、粒细胞缺乏发生率高于MEA组(P<0.05),粒细胞缺乏及发热持续时间长于MEA组(P<0.05);FLAG组CR患者ID4基因甲基化水平低于MEA组(P<0.05)。结论 FLAG方案治疗rr AML效果优于MEA方案,其机制可能与FLAG能提高地西他滨的去甲基化水平有关,但FLAG方案感染及骨髓抑制较严重,临床应进一步优化。

地西他滨联合减量FLAG方案治疗复发难治型急性髓系白血病的疗效分析

目的分析地西他滨联合减量FLAG方案治疗复发难治型急性髓系白血病的疗效。方法选取2009年9月-2012年9月收治的儿童复发难治型急性髓系白血病患者82例作为研究对象,随机分为观察组及对照组,每组各41例。对照组患者接受减量FLAG方案治疗,观察组患者接受地西他滨联合减量FLAG方案治疗。比较两组患者的治疗效果、并发症及不良反应、生存时间及死亡率等差异。结果观察组患者接受地西他滨联合减量FLAG方案治疗后的完全缓解及部分缓解率均高于对照组(P<0.05);并发症及药物不良反应发生率均低于对照组(P<0.05);随访期内生存时间、无复发生存时间高于对照组(P<0.05)。结论地西他滨联合减量FLAG方案用于难治型急性髓系白血病中,可以有效提高缓解率、降低相关不良反应发生,对于延长整体生存时间及生存率有益。

三氧化二砷联合FLAG方案治疗复发急性髓性白血病及对白血病干细胞的影响

目的:探讨三氧化二砷(Arsenic Trioxide,AT)联合改良氟达拉滨+阿糖胞苷+粒系集落刺激因子(FLAG)方案治疗复发难治急性髓性白血病(AML)的疗效以及对白血病干细胞(leukemia stem cells,LSC)的作用。方法:10例难治和复发AML患者采用AT联合FLAG方案治疗,观察临床治疗效果,并检测治疗前后患者骨髓中LSC和P-gp阳性细胞数的变化。结果:10例患者经AT联合FLAG方案治疗,持续缓解时间平均8个月(4～12个月),完全缓解率(CR)3个月、6个月和12个月分别为80%、60%和25%。10例患者均出现了Ⅳ度骨髓抑制,但未出现其它严重不良反应,无1例在治疗过程中死亡。骨髓中P-gp^+细胞由治疗前的(23.55±2.75)%降为治疗后的(11.67±3.50)%;骨髓中LSC(CD34^+CD38^-CD123^+)的相对含量显著降低,治疗前和治疗后分别为(4.30±1.30)%和(2.60±0.70)%。结论:AT联合改良FLAG方案可有效诱导难治和复发急性髓性白血病患者缓解,并降低患者骨髓中白血病干细胞(LSC)和P-gp^+细胞的数量。