鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。

非洲猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^(-1)~10^(5) copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%~3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PRRSV的最低检测模板浓度均为10 copies/μL;利用建立的二重FQ-PCR方法对130份临床样品进行检测,检测结果与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和HPPRRSV二重FQ-PCR检测方法,为ASFV和HP-PRRSV的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。

实验动物弓形虫荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立实验动物弓形虫TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对其进行初步应用。方法通过比对美国国家生物技术信息中心(NCBI)发表的弓形虫各毒株序列,选取其529 bp重复序列保守区域设计引物探针,建立弓形虫的荧光定量PCR方法。随后对方法的特异性和敏感性进行检验;取浓度为10^(6)~10^(2)copies/μL 10倍系列稀释的质粒标准品,每个浓度做3个平行,重复检测3次,计算组内和组间变异系数,评估方法的重复性和稳定性;用建立的荧光定量PCR方法及国标推荐的PCR方法检测14份犬组织样品和66份猪全血样品,以评估此方法在实际应用中的检测能力。结果建立的弓形虫荧光定量PCR方法在10^(8)~10^(1)copies/μL范围Ct值与质粒浓度呈线性关系,标准曲线Slope为-3.285,R^(2)值为1,扩增效率为10^(1).663%。可检测到的弓形虫最低浓度为10^(1)copies/μL;与其他14种实验猪常见病原不发生交叉反应;重复检测10^(6)~10^(2)copies/μL质粒标准品,组内变异系数小于1.21%,组间变异系数小于0.62%。用建立的弓形虫荧光定量PCR方法和国标PCR方法对14份犬组织样品和66份猪全血样品进行检测,结果显示,弓形虫荧光定量PCR方法和国标PCR方法检测的阳性率分别为10%(8/80)和7.5%(6/80),阳性符合率达到100%。结论建立的弓形虫荧光定量PCR方法可以有效地检测弓形虫,为实验动物弓形虫日常监测提供良好的方法。

草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用

草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到6个阳性质粒,有较高的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为0.82%与0.41%～0.52%,重复性强;对水生动物其他病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。应用该方法对采集的32份草鱼出血病样品进行检测,其中28份为阳性,而以常规RT-PCR检测同样的样品,仅23份为阳性。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒流行株实时荧光定量PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面具有较好的测试结果,在GCRV的快速检测和病毒初步定量中应用前景乐观。

氮素胁迫下强、弱化感水稻萜类代谢途径中关键酶基因差异表达的FQ-PCR分析

运用实时荧光定量PCR技术研究低氮条件下化感与非化感水稻异戊二烯代谢途径中关键酶基因的表达差异。结果表明,与正常氮条件下相比,低氮条件下化感和非化感水稻与萜类物质合成相关的12个关键酶基因表达发生了不同程度的变化,其中,化感水稻PI312777有6个基因表达下调,6个基因则上调;而非化感水稻Lemont有7个基因表达下调,5个基因表达上调。在供氮条件从高向低改变的过程中,两水稻中有11个基因的表达行为(上调或下调)相同,从分子水平上,证实了它们萜类代谢相关基因在响应供氮环境变化的行为生态上是相同或相似的。低氮引起两水稻催化生成与化感物质相关的单萜、倍半萜、二萜、三萜类物质的合成酶基因表达量均显著下降,从而认为营养胁迫引起水稻化感抑草作用增强与萜类物质代谢变化无关。还讨论了营养胁迫引起萜类物质代谢变化与内源激素合成和生长速率减缓的关系,认为水稻甲羟戊酸代谢途径支路中3-羟基-3-甲基戊二单酰CoA合酶、3-羟基-3-甲基戊二单酰CoA还原酶和甲羟戊酸激酶相关基因表达量不同程度的上调,维持了生长所必需的激素水平。

草鱼呼肠孤病毒JX-0901株FQ-PCR检测方法的建立及其在定量分析中的应用

根据GCRV JX-0901株S7基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了针对GCRV JX-0901株病毒的TaqMan实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法,并利用FQ-PCR方法对该毒株在不同鱼类细胞中的增殖情况和不同温度条件下的稳定性进行了定量分析。结果显示,建立的FQ-PCR方法的Ct值与标准品在1.0×101～1.0×108拷贝/μL浓度范围呈良好的线性关系,R2高达0.999;该方法有较好的敏感性和特异性,最低模板检出量为10个拷贝,只能特异地检测出GCRV JX-0901,不能检出其他鱼类常见病毒。该毒株能在10种常见鱼类细胞中增殖,其中在L8824细胞中的增殖量最大,含量达到4.1933×107拷贝/μL;此外,该毒株对温度敏感性较弱,病毒在48、56℃条件下放置96 h后才失去对CIK细胞感染性,而在4、15、28、37℃条件下放置32d,-20℃条件下储存2年仍具有较高的含量和较强的感染性。

肠炎沙门氏菌种特异性FQ-PCR快速检测方法的建立

根据肠炎沙门氏菌（SE）种特异性DNA序列，设计合成了一对能特异性扩增130bp片段的引物和TaqMan探针，首次建立了SE的种特异性荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR）诊断方法。该法在SEDNA含量为9×10^8-9X104拷贝有较好的线性关系；检测SEDNA模板的灵敏度为4拷贝／μL，检测SE细菌数的灵敏度为6CFU／mL；特异性试验表明只对SE基因组呈阳性反应。分别应用该技术和传统细菌分离法检测60份来自人工感染鸭、小白鼠和肉兔的心、肝、脑和直肠粪便，结果显示两种方法对心、肝、直肠粪便的阳性检测结果符合率为100％，而FQ-PCR对脑的阳性检测率极显著（P〈0．01）高于细菌分离。研究结果表明，该方法快速、灵敏、特异、重复性好且能实时定量检测，可用于SE分离鉴定、SE感染疑似病例检测、SE体内动态分布规律研究及其分子流行病学调查。

FQ-PCR检测BALF中结核杆菌-DNA对肺结核诊断的应用研究

目的:对FQ-PCR检测BALF中结核杆菌-DNA对肺结核诊断的应用进行研究。方法:随机选取2013年12月-2014年11月期间本院收治的肺结核患者110例作为本次研究的对象,所有患者实施纤支镜检查、活检、刷检,BALF中结核杆菌-DNA行FQ-PCR检测,对检查结果进行分析研究。结果:在本次研究中,确诊为肺结核的患者有40.00%(44/110);FQ-PC检测的敏感性明显高于常规涂片镜检,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在肺结核的诊断中,FQ-PCR检测的敏感度高,操作简单方便,检测速度较快,是BALF中结核杆菌-DNA检查的重要方法,在肺结核的诊断中有重要的应用价值。

FQ-PCR测定HBV DNA与ELISA检测HBV-M相关性分析

目的探讨HBV DNA含量与HBsAg S/CO值之间的相关性。方法分别用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测100例乙肝患者的HBV DNA含量和乙肝两对半,并记录HBsAg S/CO值。结果100例乙肝患者HBV DNA含量对数值为(4.28±1.89),HBsAg S/CO值为(15.09±6.64),两指标间作相关性分析,r=-0.0156,P>0.05,无相关性。结论HBV DNA是判断乙肝病毒复制的较准确、较直接的抗乙肝病毒疗效观察指标,而HBsAgS/CO值的高低与疾病的严重程度及疗效无关。

FQ-PCR检测女性泌尿生殖道炎性反应患者解脲脲原体合并感染情况分析

目的分析女性泌尿生殖道炎性反应患者解脲脲原体(Uu)合并感染淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)的情况,用以指导临床进行正确的诊断和治疗。方法采用TaqMan探针荧光定量PCR技术,对205例女性泌尿生殖道炎性反应患者进行Uu、NG和CT检测。结果在205例女性泌尿生殖道炎性反应患者中检测出Uu感染率为52.68%(108/205),NG和CT感染率均为1.46%(3/205),并且女、男单项和混合感染率比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论在女性泌尿生殖道炎性反应患者中Uu有较高的感染率,但对拟诊为Uu的患者应同时进行NG、CT检测,以免由于漏检而延误患者治疗。

FQ-PCR方法检测女性CA患者HPV_(6、11)和HPV_(16、18)的实验研究

目的:探讨女性尖锐湿疣(CA)患者HPV6、11型和HPV16、18型的感染情况。方法:采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测216例女性CA患者疣体组织或分泌物中的HPV6、11型和HPV16、18型。结果:HPV6、11型阳性率为94.91%(205/216),HPV16、18型阳性率为16.20%(35/216),HPV6、11型和HPV16、18型同时阳性的感染率为12.50%(27/216)。定量测定结果显示,HPV6、11型患者病毒载量最高1.0×108 copies/ml,最低2.8×103copies/ml;HPV16、18型患者病毒载量最高1.0×108 copies/ml,最低2.57×104 copies/ml。结论:FQ-PCR技术具有灵敏、简捷、安全、特异性强的特点,避免了单纯PCR扩增产生的假阳性。女性尖锐湿疣患者应用此方法检测HPV阳性率高,可以快速区分高危型及低危型的HPV感染,有助于对尖锐湿疣的复发和癌变作出可能性预测。

FQ-PCR检测HPV基因型的临床应用分析

目的了解人乳头瘤病毒感染患者HPV6,11型和HPV16,18型的分布。探讨HPV-DNA分型检测的临床应用价值。方法采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测1567例HPV感染者疣体组织或分泌物中的HPV6,11型和HPV16,18型。结果男女性均可感染HPV6,11和HPV16,18型,男性感染者以HPV6,11型为主,感染率为27.68%(157/567)。女性1000人次中,确诊感染HPV有659人,HPV阳性320人次,检出率为32%,其中低危型208例,即HPV6,11型阳性率为31.56%;高危型112例,即HPV16,18型为16.99%。结论FQ-PCR具有灵敏度高、特异性强、简捷方便的特点,适于临床推广应用。HPV DNA分型检测技术可以快速区分高危型及低危型HPV感染,有助于对尖锐湿疣的复发和宫颈癌变作出可能性预测。

LAMP与FQ-PCR技术检测HBV DNA的特异性和灵敏度比较

目的采用环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术与实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)技术检测HBV DNA,并对LAMP方法的反应条件进行优化,比较两种方法检测HBV DNA的灵敏度及特异性。方法选取经医院确诊的乙肝患者的血清,提取血清中的HBV DNA作为扩增模板,同时对LAMP方法的各种条件进行优化,并分别采用LAMP和FQ-PCR两种方法对同一HBV DNA模板做10倍梯度稀释的标本进行HBV DNA的检测,比较其灵敏度;分别用两种方法对乳头瘤病毒(HPV)、EB病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组DNA在相同条件下进行实验,观察两种方法在检测中是否出现假阳性结果,以确定两种方法的特异性。结果对同一HBV DNA模板进行10倍梯度稀释后,FQ-PCR技术在待测血清标本(2.38×107 copy/mL)被稀释到10-5,就难以进行准确检测,而LAMP方法在待测血清标本被稀释到10-7时,仍能获得较好的扩增结果;对HPV、EB病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组DNA进行LAMP和FQ-PCR检测,结果均为阴性。结论采用LAMP方法可以成功、快速、高效、特异地扩增HBV DNA,与FQ-PCR方法比较,都能特异地检测HBV DNA,但LAMP方法具有更高的灵敏性,操作更为简单、方便,且不需要昂贵的仪器,更适合基层检测机构推广使用。

标准品制备方法对FQ-PCR定量基因表达水平的影响

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)标准曲线法准确定量基因表达的关键在于标准品与待检样本的扩增效率是否一致.为检测DNA标准品与样本cDNA扩增效率的一致性,探讨定量用标准品的最佳制备方法,本研究以脂肪酸结合蛋白5(Fabp5)、过氧化物酶体增殖活化受体α(Ppar-α)及β肌动蛋白(β-Actin)的3个基因为对象,分别采用质粒纯化法、PCR产物直接纯化法、PCR产物凝胶回收法制备DNA标准品,10倍梯度稀释后用FQ-PCR制作标准曲线.并以10倍梯度稀释的样本cDNA标准曲线的参数为对照,进行比较分析.结果表明,不同方法制备的DNA标准品的扩增效率差异较大,并且与cDNA的扩增效率不一致,不能对cDNA样本进行准确定量.另外,虽然目的基因在cDNA样本中的拷贝未知,不能对基因表达水平进行绝对定量,但因不同cDNA样本的同一基因的扩增效率一致,可对基因的表达进行准确的相对定量.

TRFIA、FQ-PCR方法联合检测乙肝标志物的应用探讨

目的探讨检测乙肝标志物联合使用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)和荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法的应用价值.方法 2008年1月至2014年5月云南省第二人民医院检验科对门诊疑似乙肝患者2 476例,分别行TRFIA检测其血清学标志物HBV(HBV-M)和行FQ-PcR方法检测其HBv.DNA含量,并对2种方法的阳性检出率进行比较.结果 2 476例受检者中,FQ-PcR检测其HBv-DNA阳性1 656份,总阳性率为66.9%,其中TRFIA法HBsAg、HBeAg、HBcAb均阳性861份,使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性816份,占94.8%;TRFIA法HBsAg、HBeAb、HBcAb均阳性1 023例,使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性674份,占65.9%;HBsAg、HBeAg均阳性27份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性26份,占96.3%;HBsAg、HBcAb均阳性148份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性117份,占79.1%;HBsAb、HBeAb均阳性55份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性2份,占3.64%;HBsAb、HBeAb、HBcAb均阳性123份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性11份,占8.94%;HBeAb阳性22份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性2份,占9.09%;HBeAb、HBcAb均阳性43份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性3份,占6.98%;HBcAb阳性37份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性2份,占5.41%;HBsAb阳性89份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性2份,占2.22%;均阴性48份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性1份,占2.08%.结论 TRFIA法用来排查机体有无感染乙肝病毒,对于乙肝传染性强弱仅能做一个初步的估计指标,不能准确检测出血清HBV-DNA低滴度者,故靠TRFIA法诊断和判断病情是不够的;FQ-PCR法检查乙肝患者体内的乙肝病毒数量、复制指标,能够能为精确的判断出乙肝病毒在体内的复制、传染强弱情况,是对TRFIA法不足的补充.而FQ-PCR法在检测时也容易受到一些人为或非人为因素的影响.二者联合检测可提高其准确性,有利于病情的判断和诊治.

FQ-PCR检测不孕不育患者解脲支原体和沙眼衣原体

目的观察解脲支原体和沙眼衣原体的感染与不孕不育的关系。探讨实时荧光定量PCR技术在不孕不育患者的诊断和治疗中的作用。方法采用实时荧光定量PCR技术检测45对不孕不育夫妇女性宫颈分泌物、男性精液或前列腺液标本中的解脲支原体-DNA和沙眼衣原体-DNA含量。结果不孕不育患者解脲支原体-DNA阳性率37．78%,沙眼衣原体-DNA阳性率28．89%,解脲支原体或沙眼衣原体的总感染率52．22%,正常对照组则分别为15．00%、8．33%、20．00%,两组之间有显著性差异。不孕不育组中解脲支原体的感染率明显高于沙眼衣原体(P＜0．05)。女性患者解脲支原体-DNA载量和沙眼衣原体-DNA载量均高于男性患者(P＜0．05)。结论解脲支原体和沙眼衣原体是引起男女不孕不育的重要原因之一。荧光定量-PCR技术用于诊断引起不孕不育的解脲支原体或沙眼衣原体泌尿生殖道感染是安全可靠的。

FQ-PCR评价阿奇霉素治疗儿童弓形虫病疗效的初步观察

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)用于评价阿奇霉素治疗儿童弓形虫(TOX)病的效果。方法采用FQ-PCR技术,对有弓形虫病临床表现者,检测血TOX-DNA,在阳性者22例中,先天性感染12例,获得性感染10例。所有病例均用阿奇霉素在治疗2个疗程和4个疗程后,分别观察其治疗效果。结果全部患儿均有效,病情逐步好转。先天感染组治疗前患儿血TOX-DNA含量(6.21±1.17)copies/ml,治疗2个疗程后TOX-DNA含量(5.46±1.25)copies/ml(P>0.05),4个疗程后TOX-DNA含量(4.12±1.09)copies/ml(P<0.01);获得性感染组治疗前患儿血TOX-DNA含量(6.79±1.05)copies/ml,治疗2个疗程后TOX-DNA含量(6.09±1.04)copies/ml(P>0.01),4个疗程后TOX-DNA含量(4.06±0.95)copies/ml(P<0.01)。结论22例弓形虫感染患儿服用阿奇霉素治疗,效果显著,未见明显毒副作用,患儿依从性好。

应用FQ-PCR技术测定鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA定量分析及其临床意义

目的应用FQ-PCR技术测定鼻咽癌患者血浆中游离EB病毒DNA拷贝,探讨血浆EB病毒DNA定量测定的临床意义。方法选取132例鼻咽癌患者,取其外周血样本,其中84例治疗前血样,48例治疗后血样(放疗或加化疗)。另收集60例健康血样作为正常对照。使用广州中山医科大学达安基因诊断中心提供(Cat.#DA-061)的EB病毒DNA-PCR试剂盒,测定鼻咽癌患者血浆中游离EB病毒DNA拷贝,阴性对照为空白PCR反应液,阳性对照为10~6、10~4、10~2拷贝/ul的阳性模板。结果鼻咽癌组治疗前84例样本,阳性率为67.86%,鼻咽癌组治疗后48例样本阳性率为35.42%,正常对照者30例样本阳性率仅为8.33%,鼻咽癌组治疗前血浆游离EB病毒DNA的阳性率显著高于对照组,差异显著(χ~2=11.497,P=0.001);鼻咽癌组治疗后与对照组血浆游离EB病毒DNA的阳性率比较,差异较显著(χ~2=6.782,P=0.018);鼻咽癌组治疗前血浆中游离EB病毒-DNA阳性率约是治疗后的2倍,差异显著(χ~2=6.271,P=0.023)。鼻咽癌组治疗前血浆游离EB病毒DNA拷贝中位数为522.0 copies/ml,治疗后中位数为0.0,对照组中位数为0.0,鼻咽癌组治疗前的血浆游离EB病毒DNA拷贝数显著高于治疗后,两者差异具有统计学意义(U=350.0,P=0.029),而且与正常对照组拷贝数比较,差异亦显著(U=274.0,P=0.001)。Ⅰ~Ⅱ期患者的血浆游离EB病毒DNA水平显著低于Ⅲ~Ⅳ期患者(U=141.0,P=0.039)。N_0+N_1期患者的血浆EB病毒DNA水平显著低于N_2+N_3期患者(U=147.0,P=0.031)。结论 FQ-PCR技术具有快速、精确和高灵敏性的特点,比其它传统检测手段更实用。血浆EB病毒DNA的定量PCR分析对鼻咽癌的筛选检查具有应用价值。

支气管肺泡灌洗液FQ-PCR检测TB-DNA与TB培养在肺结核诊断中的价值

目的评价支气管肺泡灌洗液(BALF)荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测TB-DNA与TB培养两种方法在肺结核诊断中的临床价值。方法回顾分析南京市胸科医院2016年4月到12月收治的587例初次住院患者标本,其中肺结核组525例,非肺结核组62例,收集所有患者的BALF标本,同时做TB-DNA(FQ-PCR法)检测和TB培养,比较两方法的阳性率差异和性能指标。结果 (1)BALF的TB-DNA(FQ-PCR法)和TB培养的阳性率分别为41.40%和31.86%,两种方法阳性率比较差异有统计学意义(P<0.01)。(2)两种方法在肺结核诊断中的灵敏度分别为46.1%和35.62%,特异度分别为98.39%和100%,阳性预测值分别为99.59%和100%,阴性预测值分别为17.73%和15.50%、诊断效率分别为51.62%和42.42%。(3)两种方法联合检测在肺结核诊断中的灵敏度为52.19%,特异度为98.39%,阳性预测值为99.64%,阴性预测值为19.55%,诊断效率为57.07%。结论 BALF的TB-DNA(FQ-PCR法)和TB培养两方法在肺结核的诊断上均有较好的临床应用价值,BALF的FQ-PCR检测TB-DNA和TB培养联合检测,能更有效的提高肺结核诊断率。

HBV前C区部分序列亚克隆与FQ-PCR标准曲线的制备

目的探讨HBV前C区基因用于乙型病毒性肝炎早期诊断价值和意义并基于此靶基因制备荧光定量PCR标准曲线。方法设计特异性引物,将pBR322-HBV质粒前C区部分序列PCR产物AT亚克隆至pBS-T载体,提取和纯化质粒DNA,制作标准品并在FQ-PCR仪上得到标准曲线,进而对精确度和重复性进行统计分析。结果获得了预期希望的质粒。荧光定量PCR标准曲线的相关系数为0.995,线性范围5×103 copies/μl^5×109 copies/μl。批内、批间变异系数值均小于5%,精确度高,重复性好。结论HBV前C区基因用于乙型病毒性肝炎早期检测和诊断有一定价值和意义。且FQ-PCR标准曲线的成功制备,临床早期检测乙肝病毒感染奠定了基础。