鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。

氮素胁迫下强、弱化感水稻萜类代谢途径中关键酶基因差异表达的FQ-PCR分析

运用实时荧光定量PCR技术研究低氮条件下化感与非化感水稻异戊二烯代谢途径中关键酶基因的表达差异。结果表明,与正常氮条件下相比,低氮条件下化感和非化感水稻与萜类物质合成相关的12个关键酶基因表达发生了不同程度的变化,其中,化感水稻PI312777有6个基因表达下调,6个基因则上调;而非化感水稻Lemont有7个基因表达下调,5个基因表达上调。在供氮条件从高向低改变的过程中,两水稻中有11个基因的表达行为(上调或下调)相同,从分子水平上,证实了它们萜类代谢相关基因在响应供氮环境变化的行为生态上是相同或相似的。低氮引起两水稻催化生成与化感物质相关的单萜、倍半萜、二萜、三萜类物质的合成酶基因表达量均显著下降,从而认为营养胁迫引起水稻化感抑草作用增强与萜类物质代谢变化无关。还讨论了营养胁迫引起萜类物质代谢变化与内源激素合成和生长速率减缓的关系,认为水稻甲羟戊酸代谢途径支路中3-羟基-3-甲基戊二单酰CoA合酶、3-羟基-3-甲基戊二单酰CoA还原酶和甲羟戊酸激酶相关基因表达量不同程度的上调,维持了生长所必需的激素水平。

草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用

草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到6个阳性质粒,有较高的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为0.82%与0.41%～0.52%,重复性强;对水生动物其他病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。应用该方法对采集的32份草鱼出血病样品进行检测,其中28份为阳性,而以常规RT-PCR检测同样的样品,仅23份为阳性。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒流行株实时荧光定量PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面具有较好的测试结果,在GCRV的快速检测和病毒初步定量中应用前景乐观。

草鱼呼肠孤病毒JX-0901株FQ-PCR检测方法的建立及其在定量分析中的应用

根据GCRV JX-0901株S7基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了针对GCRV JX-0901株病毒的TaqMan实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法,并利用FQ-PCR方法对该毒株在不同鱼类细胞中的增殖情况和不同温度条件下的稳定性进行了定量分析。结果显示,建立的FQ-PCR方法的Ct值与标准品在1.0×101～1.0×108拷贝/μL浓度范围呈良好的线性关系,R2高达0.999;该方法有较好的敏感性和特异性,最低模板检出量为10个拷贝,只能特异地检测出GCRV JX-0901,不能检出其他鱼类常见病毒。该毒株能在10种常见鱼类细胞中增殖,其中在L8824细胞中的增殖量最大,含量达到4.1933×107拷贝/μL;此外,该毒株对温度敏感性较弱,病毒在48、56℃条件下放置96 h后才失去对CIK细胞感染性,而在4、15、28、37℃条件下放置32d,-20℃条件下储存2年仍具有较高的含量和较强的感染性。

FQ-PCR检测宫颈涂片剩余细胞内HPV16、18型感染的临床意义

目的 :探讨实时荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)检测宫颈涂片剩余细胞内人乳头瘤病毒 (HPV) 16、18型感染 ,建立快速、灵敏的检测方法的临床意义。方法 :采用FQ PCR技术检测 12 4例异常宫颈细胞和组织标本HPV16、18型感染状况。结果 :细胞学诊断低度鳞状上皮内病变 (LSIL) 4 5例 ,其中FQ PCR检测宫颈细胞标本HPV16、18型DNA阳性14例 (阳性率 31.1% ) ;高度鳞状上皮内病变 (HSIL) 38例 ,HPV16、18型DNA阳性 2 6例 (6 8.4 % ) ;未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞 (ASCUS) 30例 ,HPV16、18型DNA阳性 10例 (33.3% ) ;鳞状细胞癌 9例 ,HPV16、18型DNA阳性 8例 (88.9% )。组织学检查诊断CINⅠ级 6 7例 ,其中FQ PCR检测活检组织标本HPV16、18型DNA阳性 2 8例 (阳性率 4 1.8% ) ;CINⅡ 14例 ,HPV16、18型DNA阳性 9例 (6 4 .3% ) ;CINⅢ级 11例 ,HPV16、18型DNA阳性 8例 (72 .7% ) ;鳞状细胞癌 2 3例 ,HPV16、18型DNA阳性 17例 (73.9% )。细胞和活检组织两种标本检出的HPV16、18型DNA阳性率差异无显著性 (χ2=1.5 4 ,P >0 .0 5 )。结论 :FQ PCR方法检测宫颈细胞标本HPV16、18型感染 ,具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点 。

肠炎沙门氏菌种特异性FQ-PCR快速检测方法的建立

根据肠炎沙门氏菌（SE）种特异性DNA序列，设计合成了一对能特异性扩增130bp片段的引物和TaqMan探针，首次建立了SE的种特异性荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR）诊断方法。该法在SEDNA含量为9×10^8-9X104拷贝有较好的线性关系；检测SEDNA模板的灵敏度为4拷贝／μL，检测SE细菌数的灵敏度为6CFU／mL；特异性试验表明只对SE基因组呈阳性反应。分别应用该技术和传统细菌分离法检测60份来自人工感染鸭、小白鼠和肉兔的心、肝、脑和直肠粪便，结果显示两种方法对心、肝、直肠粪便的阳性检测结果符合率为100％，而FQ-PCR对脑的阳性检测率极显著（P〈0．01）高于细菌分离。研究结果表明，该方法快速、灵敏、特异、重复性好且能实时定量检测，可用于SE分离鉴定、SE感染疑似病例检测、SE体内动态分布规律研究及其分子流行病学调查。

LAMP与FQ-PCR技术检测HBV DNA的特异性和灵敏度比较

目的采用环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术与实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)技术检测HBV DNA,并对LAMP方法的反应条件进行优化,比较两种方法检测HBV DNA的灵敏度及特异性。方法选取经医院确诊的乙肝患者的血清,提取血清中的HBV DNA作为扩增模板,同时对LAMP方法的各种条件进行优化,并分别采用LAMP和FQ-PCR两种方法对同一HBV DNA模板做10倍梯度稀释的标本进行HBV DNA的检测,比较其灵敏度;分别用两种方法对乳头瘤病毒(HPV)、EB病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组DNA在相同条件下进行实验,观察两种方法在检测中是否出现假阳性结果,以确定两种方法的特异性。结果对同一HBV DNA模板进行10倍梯度稀释后,FQ-PCR技术在待测血清标本(2.38×107 copy/mL)被稀释到10-5,就难以进行准确检测,而LAMP方法在待测血清标本被稀释到10-7时,仍能获得较好的扩增结果;对HPV、EB病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组DNA进行LAMP和FQ-PCR检测,结果均为阴性。结论采用LAMP方法可以成功、快速、高效、特异地扩增HBV DNA,与FQ-PCR方法比较,都能特异地检测HBV DNA,但LAMP方法具有更高的灵敏性,操作更为简单、方便,且不需要昂贵的仪器,更适合基层检测机构推广使用。

ELISA法检测抗-HCV-IgG抗体以及FQ-PCR检测血清HCV-RNA在丙型肝炎诊断中的应用价值

目的探讨酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测抗-HCV-IgG抗体以及实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测血清HCV-RNA在丙型肝炎诊断中的应用价值。方法对70例肝病科及肾病科丙型肝炎病毒(HCV)待查者血清标本,同时采用ELISA法检测抗-HCV-IgG抗体滴度,FQ-PCR法检测HCV-RNA载量,全自动生化分析仪检测ALT、AST,分析不同检测结果组合类型的HCV-RNA载量或抗-HCV-IgG抗体滴度与ALT、AST、AST/ALT值的关系。结果在70例血清标本中,用ELISA法检测到抗-HCV-IgG(+)(S/C.O.值≥1)有49例,使用FQ-PCR法检测到HCV-RNA(+)(载量≥5.0×102IU/m L)有51例。男女之间感染率差异无统计学意义(P<0.05),但不同年龄组感染率差异有统计学意义(P<0.05)。单阳性型患者与双阳性型患者的血清ALT异常率、AST异常率或AST/ALT倒置率(AST/ALT>1)差异均无统计学意义(均P>0.05)。HCV-RNA(+)且抗-HCV-IgG(+)患者的lgHCV-RNA载量与抗-HCV-IgG抗体S/C.O.值、ALT水平均呈线性正相关(r值分别为0.586、0.521,均P<0.05),但是与AST/ALT值不呈线性相关(r=-0.076,P>0.05)。HCV-RNA(+)且抗-HCV-IgG(-)患者的lg HCV-RNA载量与ALT水平、AST/ALT值均无直线相关关系存在(r值分别为-0.333、0.611,均P>0.05)。HCV-RNA(-)且抗-HCV-Ig G(+)患者的抗-HCV-IgG抗体S/C.O.值与ALT水平、AST/ALT值也无直线相关关系存在(r值分别为0.485、0.563,均P>0.05)。结论单一使用ELISA法检测抗-HCV-IgG抗体或FQ-PCR法检测HCV-RNA,对于丙型肝炎的诊断都有一定局限性。同时应用ELISA法和FQ-PCR法进行检测时,不同结果组合类型的患者,其HCV-RNA载量或抗-HCV-IgG抗体S/C.O.值与ALT水平、AST/ALT值的相关性并不一致。

TRFIA、FQ-PCR方法联合检测乙肝标志物的应用探讨

目的探讨检测乙肝标志物联合使用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)和荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法的应用价值.方法 2008年1月至2014年5月云南省第二人民医院检验科对门诊疑似乙肝患者2 476例,分别行TRFIA检测其血清学标志物HBV(HBV-M)和行FQ-PcR方法检测其HBv.DNA含量,并对2种方法的阳性检出率进行比较.结果 2 476例受检者中,FQ-PcR检测其HBv-DNA阳性1 656份,总阳性率为66.9%,其中TRFIA法HBsAg、HBeAg、HBcAb均阳性861份,使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性816份,占94.8%;TRFIA法HBsAg、HBeAb、HBcAb均阳性1 023例,使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性674份,占65.9%;HBsAg、HBeAg均阳性27份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性26份,占96.3%;HBsAg、HBcAb均阳性148份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性117份,占79.1%;HBsAb、HBeAb均阳性55份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性2份,占3.64%;HBsAb、HBeAb、HBcAb均阳性123份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性11份,占8.94%;HBeAb阳性22份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性2份,占9.09%;HBeAb、HBcAb均阳性43份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性3份,占6.98%;HBcAb阳性37份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性2份,占5.41%;HBsAb阳性89份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性2份,占2.22%;均阴性48份,其中使用FQ-PCR法检测HBV-DNA的含量阳性1份,占2.08%.结论 TRFIA法用来排查机体有无感染乙肝病毒,对于乙肝传染性强弱仅能做一个初步的估计指标,不能准确检测出血清HBV-DNA低滴度者,故靠TRFIA法诊断和判断病情是不够的;FQ-PCR法检查乙肝患者体内的乙肝病毒数量、复制指标,能够能为精确的判断出乙肝病毒在体内的复制、传染强弱情况,是对TRFIA法不足的补充.而FQ-PCR法在检测时也容易受到一些人为或非人为因素的影响.二者联合检测可提高其准确性,有利于病情的判断和诊治.

应用FQ-PCR技术测定鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA定量分析及其临床意义

目的应用FQ-PCR技术测定鼻咽癌患者血浆中游离EB病毒DNA拷贝,探讨血浆EB病毒DNA定量测定的临床意义。方法选取132例鼻咽癌患者,取其外周血样本,其中84例治疗前血样,48例治疗后血样(放疗或加化疗)。另收集60例健康血样作为正常对照。使用广州中山医科大学达安基因诊断中心提供(Cat.#DA-061)的EB病毒DNA-PCR试剂盒,测定鼻咽癌患者血浆中游离EB病毒DNA拷贝,阴性对照为空白PCR反应液,阳性对照为10~6、10~4、10~2拷贝/ul的阳性模板。结果鼻咽癌组治疗前84例样本,阳性率为67.86%,鼻咽癌组治疗后48例样本阳性率为35.42%,正常对照者30例样本阳性率仅为8.33%,鼻咽癌组治疗前血浆游离EB病毒DNA的阳性率显著高于对照组,差异显著(χ~2=11.497,P=0.001);鼻咽癌组治疗后与对照组血浆游离EB病毒DNA的阳性率比较,差异较显著(χ~2=6.782,P=0.018);鼻咽癌组治疗前血浆中游离EB病毒-DNA阳性率约是治疗后的2倍,差异显著(χ~2=6.271,P=0.023)。鼻咽癌组治疗前血浆游离EB病毒DNA拷贝中位数为522.0 copies/ml,治疗后中位数为0.0,对照组中位数为0.0,鼻咽癌组治疗前的血浆游离EB病毒DNA拷贝数显著高于治疗后,两者差异具有统计学意义(U=350.0,P=0.029),而且与正常对照组拷贝数比较,差异亦显著(U=274.0,P=0.001)。Ⅰ~Ⅱ期患者的血浆游离EB病毒DNA水平显著低于Ⅲ~Ⅳ期患者(U=141.0,P=0.039)。N_0+N_1期患者的血浆EB病毒DNA水平显著低于N_2+N_3期患者(U=147.0,P=0.031)。结论 FQ-PCR技术具有快速、精确和高灵敏性的特点,比其它传统检测手段更实用。血浆EB病毒DNA的定量PCR分析对鼻咽癌的筛选检查具有应用价值。

支气管肺泡灌洗液FQ-PCR检测TB-DNA与TB培养在肺结核诊断中的价值

目的评价支气管肺泡灌洗液(BALF)荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测TB-DNA与TB培养两种方法在肺结核诊断中的临床价值。方法回顾分析南京市胸科医院2016年4月到12月收治的587例初次住院患者标本,其中肺结核组525例,非肺结核组62例,收集所有患者的BALF标本,同时做TB-DNA(FQ-PCR法)检测和TB培养,比较两方法的阳性率差异和性能指标。结果 (1)BALF的TB-DNA(FQ-PCR法)和TB培养的阳性率分别为41.40%和31.86%,两种方法阳性率比较差异有统计学意义(P<0.01)。(2)两种方法在肺结核诊断中的灵敏度分别为46.1%和35.62%,特异度分别为98.39%和100%,阳性预测值分别为99.59%和100%,阴性预测值分别为17.73%和15.50%、诊断效率分别为51.62%和42.42%。(3)两种方法联合检测在肺结核诊断中的灵敏度为52.19%,特异度为98.39%,阳性预测值为99.64%,阴性预测值为19.55%,诊断效率为57.07%。结论 BALF的TB-DNA(FQ-PCR法)和TB培养两方法在肺结核的诊断上均有较好的临床应用价值,BALF的FQ-PCR检测TB-DNA和TB培养联合检测,能更有效的提高肺结核诊断率。

FQ-PCR检测肠黏膜结核杆菌DNA对肠结核的诊断价值

目的建立一种实时定量检测结核分枝杆菌(MTB)插入序列IS6110 DNA的方法,探讨其在肠结核(ITB)诊断中的价值。方法采用FQ-PCR技术对36例内镜活检ITB标本(30例石蜡、6例新鲜组织)、36例Crohn’s disease标本(16例石蜡手术标本,15例石蜡内镜活检标本,5例新鲜内镜活检组织)及34例阴性对照标本进行IS6110 DNA的实时定量检测,并比较上述标本抗酸染色结果。结果13例ITB抗酸染色阳性,CD无1例阳性,抗酸染色对ITB诊断的敏感性36.11%。MTBIS6110DNA检测结果:23例ITB(63.89%)阳性,6例CD(16.67%)阳性,另有1例阳性为升结肠腺癌癌旁正常组织。MTBIS6110 DNA在ITB与CD中的阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。FQ-PCR对ITB诊断的敏感性为63.89%,特异性83.33%。FQ-PCR敏感性显著高于抗酸染色(P<0.05)。MTBIS6110 DNA阳性的ITB标本其定量结果范围为2.44×10-4-2.26×101拷贝/细胞。结论FQ-PCR检测MTBIS6110 DNA是一种快速有效的ITB诊断方法,其定量范围广,检测灵敏度高。对活检组织少、病理改变不典型、抗酸染色阴性组织的诊断和鉴别诊断尤有意义。

FQ-PCR法和染色涂片法检测脑脊液结核杆菌结果对比分析及意义

目的通过荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)法和染色涂片法检测脑脊液(CSF)结核杆菌,结果与临床确诊结果进行对比分析,探寻提高抗酸杆菌(AFB)的检出率的检验方法。方法近年来怀疑结核性脑膜炎患者62例,取脑脊液用两种方法检测结核杆菌。结果 FQ-PCR和染色涂片阳性率分别为14.52%和4.84%。结论 FQ-PCR技术是一种快速、敏感、特异性较强的结核分枝杆菌辅助诊断方法。在检测脑脊液结核杆菌有其应用价值和意义。

运用FQ-PCR技术监测亚甲蓝光化学法对血浆丙型肝炎病毒的灭活效果

目的:通过荧光定量PCR（FQ-PCR）技术对血浆病毒灭活前后丙型肝炎病毒RNA（HCV-RNA）浓度的测定,判断亚甲蓝（MB）光化学法灭活血浆丙型肝炎病毒的效果,为临床判别病毒灭活效果提供直接和客观依据。方法:4份经证实为HCV-RNA阳性的血浆分别加入MB,终浓度为1μmol/L,经可见光（大于30000Lux）照射不同时间（0、5、10、15和30min）后,分别用FQ-PCR测定这些血浆的HCV-RNA浓度,并与未用MB处理的血浆作比较,判断随照射时间不同,HCV被灭活的效果。结果:4份HCV-RNA阳性病人的血浆未经处理时其病毒核酸浓度分别为8.0X105拷贝/ml、1.7X106拷贝/ml、1.6X106拷贝/ml和 3.1X105拷贝/ml,加入MB未经照射时HCV-RNA浓度即明显下降,可见光照射5 min后HCV-RNA浓度分别下降为未经任何处理时浓度的18.75％、23.36％、4.66％和1.27％,随照射时间延长,病毒核酸浓度逐渐下降,照射30min后,HCV-RNA浓度均下降为零。结论:用MB加光照30min处理,可达到将血浆丙肝病毒灭活的效果;FQ-PCR可定量检测MB光化学法灭活丙肝病毒的过程。

FQ-PCR检测HCV-RNA载量与ALT相关性探讨

目的:对本地区抗-HCV阳性患者其丙肝病毒核酸(HCV-RNA)载量与ALT(丙氨基转移酶)水平值的相关性进行探讨。方法:回顾性分析医院近年来用FQ-PCR检测抗-HCV阳性的HCV-RNA载量和ALT的水平数值125例患者的资料,进行统计处理归纳。结果:125例样本中,HCV-RNA阳性率为84.8%,ALT异常率为56.0%,ALT水平值和异常率随着HCV-RNA载量升高而增加。结论:HCV-RNA载量与ALT的水平值之间呈正相关性,ALT水平值可以成为反映HCV-RNA造成肝细胞、肝脏组织损伤的敏感指标。

FQ-PCR溶解曲线技术分析白血病患者PBMC中T细胞TCRα/βCDR3谱系特征

目的采用FQ-PCR溶解曲线技术分析临床白血病患者外周血单个核细胞(PBMC)中T细胞TRAV和TRBV基因各家族的CDR3谱系特征。方法提取4例健康志愿者和15例临床白血病患者PBMC中mRNA,逆转录成cDNA,FQ-PCR扩增32个TRAV基因和24个TRBV基因家族的CDR3区,FQ-PCR溶解曲线技术分析CDR3谱系特征,并测序分析单克隆家族CDR3区氨基酸序列的组成。结果 4例健康志愿者PBMC中α/βT细胞的CDR3谱系FQ-PCR溶解曲线峰型图,均表现为多峰图;而15例白血病患者PBMC中α/βT细胞CDR3谱系FQ-PCR溶解曲线峰型图,多数患者出现寡或偏峰型图、低或无峰型图、典型的单峰型图;不同白血病患者异常峰的频率不一致;单峰型图TRAV和TRBV PCR产物基因测序,未发现不同患者存在完全相同的CDR3区。结论FQ-PCR溶解曲线技术能很好的分析白血病患者PBMC中TCRα/βCDR3谱系的单、寡、多克隆性增殖;非T细胞白血病患者PBMC中TCRα/βCDR3的单峰(或寡峰)家族T细胞,可能来源于机体对肿瘤应答的T细胞,而在T细胞白血病患者,可能为肿瘤T细胞或机体抗肿瘤T细胞。本实验可为进一步研究白血病的免疫应答机制和个体化治疗提供基础。

用FQ-PCR方法快速检测水产品中副溶血弧菌

〔目的〕采用荧光定量PCR技术 ,研制适合各层次实验室使用的 ,快速、准确地检测与鉴定食品中副溶血弧菌污染的定性、定量检测试剂盒。〔方法〕根据副溶血弧菌gyrase基因序列 ,设计并合成特异性引物和荧光标记探针 ,将扩增后的特异片断制成阳性模板 ,绘制标准曲线。以副溶血弧菌菌株 8株及同源及非同源参考菌株 2 4株 ,做特异性检测 ;将阳性污染菌按梯度加入阴性样品为模拟样本 ,做敏感性检测。同时使用PE70 0 0型定量PCR仪和国产DA6 2 0微量荧光检测仪检测。〔结果〕该方法有良好的特异性 :8株副溶血弧菌结果均为阳性 ,而其他 2 4株菌株均为阴性 (其中 8株是弧菌科 ,其它 15株分别来自不同的菌属 ) ;该方法有良好的敏感性 :阳性模板浓度与定量曲线循环阈值之间具有良好的线性关系 ,相关系数达到 0 .9871。直接进行定量检测 ,则检测低限在 10 2cfu/g;经过 2 4小时增菌培养 ,检测低限可达 2cfu/g。〔结论〕该方法特异性强、敏感性高 ,操作简便快速 ,能避免常规PCR方法易污染的缺陷 ,在国产仪器上测试同样取得较好的敏感性和特异性 ,便于基层实验室使用 ,具有很好的推广应用前景。