RT-fqPCR检测腐乳耐药基因方法的建立及应用

该研究根据腐乳中微生物全基因组测序结果中耐药基因的丰度筛选出3种耐药基因(Baca、Emra、Imrp)设计引物,建立一种非培养方式—实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-fqPCR)方法检测不同腐乳样品中微生物可能存在的耐药基因,并对该方法的灵敏度、抗干扰能力及重复性进行检测,最后应用于市售腐乳样品中耐药基因的检测。结果表明,建立的RT-fqPCR方法对3种耐药基因检测的灵敏度较高,均达到5.4 pg;添加黄豆基因对检测结果影响不显著,抗干扰能力较好;重复性试验结果的相对标准偏差(RSD)均<1.8%,重复性较好。采用该方法对市售的47批次腐乳样品进行检测发现,3种耐药基因Baca、Emra、Imrp在腐乳中的检出率较高,分别为96.5%、92.2%和97.2%;青方腐乳、白方腐乳、红方腐乳3类腐乳含有的耐药基因分别为84.4%、83.3%和89.6%。综上,建立的RT-fqPCR方法可快速检测不同腐乳中的3种耐药基因。

利用RT-fqPCR技术鉴定益生菌粉中的植物乳杆菌

利用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-fqPCR)技术对益生菌粉中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)进行快速精准鉴定。选取植物乳杆菌的16S rRNA基因,利用Primer Express 3.0.1设计引物探针,验证引物探针的特异性、灵敏度和抗干扰性,建立植物乳杆菌的RT-fqPCR检测方法。益生菌粉中菌株未经过平板培养分离,直接对样品进行脱氧核糖核酸(DNA)提取,利用RT-fqPCR技术对植物乳杆菌进行快速精准鉴定。结果表明,所设计的引物探针可以有效的扩增植物乳杆菌,具有良好的特异性;灵敏度在DNA水平可以达到1 pg/μL,并且具有很好的抗干扰性,对12种益生菌粉样品直接提取的DNA进行RT-fqPCR快速鉴定,其中有10种益生菌样品粉检测出植物乳杆菌。

HBV-DNA荧光定量PCR检测的临床意义

目的通过与血清标志物(HBV-M),血清ALT的比较,探讨血清乙肝病毒DNA荧光定量PCR检测的临床意义及其与病毒复制程度变化的关系与原因。方法采用FQPCR法对慢性乙肝病人进行血清HBVDNA定量检测并与血清中乙肝标志物及血清ALT进行相关性分析。结果血清HBVDNA水平与HBVM表现模式有关,其水平变化与HBsAgHBeAg有明显正相关关系,血清HBVDNA水平与ALT成负相关。结论HBV-DNA含量与HBeAg有明显关系,抗HBe阳性患者HBV-DNA含量仍高,病毒突变是其重要原因。HBV-DNAFQPCR检测能更准确地反映病毒复制程度,对乙肝的诊断治疗预后意义重大。

乙型肝炎病毒DNA定量与ALT的相关分析

目的探讨HBsAg+、HBeAg+、HBcAb+(简称"大三阳)"及HBsAg+、HBeAb+、HBcAb+(简称"小三阳)"乙型肝炎(简称"乙肝)"患者病毒DNA(HBV DNA)与ALT的相互关系。方法选择1191份乙肝患者血清标本(其中大三阳192例,小三阳999例),HBV DNA测定采用FQ PCR法,ALT检测采用酶法,对其检测结果进行分析。结果大三阳组和小三阳组HBV DNA与ALT值的差异均有高度统计学意义(P<0.01)。大三阳组HBV DNA异常率(91.67%)和ALT异常率(60.42%)显著高于小三阳组(21.62%、28.13%)(P<0.01),但HBV DNA与ALT并无相关性。结论大三阳患者HBV DNA含量及肝损伤程度高于小三阳患者,但HBV DNA与ALT并不相关,HBV DNA与ALT两者同时测定有助于更明确地反映患者体内病毒的感染情况。

慢性乙肝病情进展中病毒复制程度的研究

目的:研究慢性乙型肝炎病情进展中病毒复制程度的变化并探讨其原因。方法 :采用FQPCR法对慢性乙型肝炎病人进行血清HBVDNA定量检测 ,并与血清ALT和TSB进行相关性分析。结果 :轻、中、重度慢性乙型肝炎HBeAg阳性率分别为 72 .1% ,6 0 .5 %和 4 0 %。HBVDNA阳性率分别为 78.7% ,6 8.4 %和 5 3.3% ,轻、重度两组比较有显著性差异 (P <0 .0 0 5 )。HBVDNA定量在轻、中、重度组分别为 (8.2 6± 1.12 ) ,(7.95±1.0 2 )和 (7.35± 0 .94 ) ,轻、重度两组比较有显著性差异 (P <0 .0 5 )。血清HBVDNA定量与血清ALT和TSB呈负相关 (P <0 .0 1,P <0 .0 2 )。结论 :在慢性乙型肝炎病情进展中 ,HBV复制程度逐渐下降。

狼疮样BXSB小鼠脾细胞CD134/CD134L的表达及治疗影响

为了探讨CD134/CD134L共刺激信号在SLE发病机制中的可能作用及治疗的影响。采用狼疮样BXSB小鼠模型,随机分为三组:狼疮方治疗组、强的松治疗组、未治疗组,每组6只,疗程10周。另设与BXSB小鼠同基因的正常C57BL/6小鼠6只为正常对照组。分别采集上述各组小鼠外周血和脾组织进行检测。结果:(1)与正常对照组比较,未治疗组BXSB小鼠的血清IgG和抗dsDNA抗体水平和脾组织CD4+CD134+、CD8+CD134+、CD19+CD134L+、CD23+CD134L+的百分比及CD134、CD134L的mRNA拷贝数都显著增高(P<0.05或P<0.01)。且血IgG和抗dsDNA抗体水平与脾细胞CD19+CD134L、CD23+CD134L的水平增加呈正相关;(2)狼疮方治疗组或强的松治疗组的血清IgG、抗dsDNA抗体水平和脾组织CD4+CD134+、CD8+CD134+、CD19+CD134L+、CD23+CD134L+的百分比及CD134、CD134L的mRNA拷贝数都显著低于未治疗组(P<0.05或P<0.01),而与正常对照组无显著差异(P均>0.05)。狼疮样BXSB小鼠存在CD134/CD134L的异常表达。狼疮方可减轻狼疮样小鼠高丙种球蛋白血症,减少体内自身抗体产生,对CD134/CD134L的下调作用与强的松相当。

褐飞虱体内Himetobi P病毒的检测及组织定位

通过对Himetobi P病毒(HiPV)在褐飞虱[Nilaparvata lugens(Stl)]不同地理种群之间的差异、不同发育阶段的感染水平及不同器官组织的感染情况等方面的研究,为进一步研究HiPV与褐飞虱的互作及HiPV的应用奠定基础.对采自亚洲各地的10个褐飞虱种群进行实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitationpolymerase chain reaction,FQ-PCR)检测,发现所有检测的种群都携带有HiPV.根据HiPV衣壳蛋白编码序列进行聚类分析表明,不同地理来源宿主的病毒聚类与采集的地理远近并不一致.该病毒对褐飞虱没有明显的致病作用,可能是一种共生病毒.FQ-PCR分析表明,褐飞虱体内HiPV的相对含量随褐飞虱龄期的增大而缓慢增加,在成虫期达到高峰,且成虫中雄虫的带毒量高于雌虫.以FQ-PCR和免疫组织化学对宿主不同组织的病毒感染水平进行检测表明,HiPV在宿主的中肠后端部分感染水平最高,马氏管次之,而卵巢、精巢、唾液腺、脂肪体中含量较低.

荧光定量PCR观察鸭胚肝细胞培养上清DHBV载量的动态变化

通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)观察后天感染和先天感染鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的鸭胚肝细胞培养上清中DHBV载量的动态变化,探讨适宜于抗HBV药物的体外实验、HBV生物学特性及乙型肝炎发病机制研究的鸭胚肝细胞模型。筛选先天感染DHBV的阳性鸭胚并进行肝细胞原代培养,对DHBV阴性鸭胚肝细胞原代培养,并以不同浓度的DHBV强阳性血清感染细胞。于细胞接种后不同时间点收集培养上清,FQ-PCR检测分析培养上清DHBV DNA的含量。结果显示:先天感染的鸭胚肝细胞接种第2 d上清中DHBV载量最高,第3 d大幅下降,然后缓慢上升,第8 d达到高峰,至第15 d时仍然与高峰时接近,DHBV载量的数量级都在108cop ies/mL没有变化;后天感染不同浓度的DHBV阳性血清的鸭胚肝细胞培养上清中的DHBV载量动态变化趋势基本一致,DHBV感染后第3 d大幅下降,以后逐渐上升,至第11 d达高峰,第15 d又略有下降。结论:先天感染DHBV的鸭胚肝细胞的培养上清病毒载量上升至峰值时间短,病毒载量稳定,更适合于抗HBV药物的体外实验研究。

高通量测序技术在传统发酵食品微生物群落中的应用研究

传统发酵食品风味独特,营养丰富,历史悠久,生产方式多采用自然接种,部分食品的生产工艺已有数千年的历史,其最终质量与发酵过程中存在的多种微生物密切相关。研究表明,运用现代分子生物学技术,可从基因水平上揭示微生物的多样性和群落结构的动态变化,系统阐明其发酵机理。该文综述高通量测序技术在传统发酵食品微生物群落中的应用研究,对聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)、实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-FQPCR)、宏基因组、宏转录组测序等研究方法的原理、操作方法及其研究成果进行了总结,并对各分析技术优缺点进行了比较,旨在为传统发酵食品的微生物群落研究提供参考。

不同样本检测单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA的结果差异

目的了解不同类型的标本检测单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSVⅡ)-DNA的结果差异。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)对240例疑似是生殖器疱疹(GH)患者的不同送检样本的HSVⅡ-DNA进行检测。结果240例疑似GH患者共检出HSVⅡ-DNA阳性142例,总阳性率为59.17%。不同临床样本HSVⅡ-DNA阳性检出率差异有统计学意义(χ2=118.06、P<0.01),水疱液和溃疡渗出液样本阳性检出率高于男性尿道拭子、女性尿道拭子和女性宫颈拭子,差异有统计学意义(χ2=114.96、P<0.01)。不同样本检测为阳性的HSVⅡ-DNA的拷贝数用Kruskal-Wallis法秩和检验进行比较,结果差异有统计学意义(H=13.68、P<0.01),水疱液和溃疡渗出液阳性样本的病毒载量高于其他样本。结论对于GH患者,应充分认识到用FQ-PCR法检测HSVⅡ-DNA时其标本采取方法和标本种类的重要性,尽量采取到水疱液或皮损部位组织液和溃疡渗出液送检,以便获得较高的阳性结果。

未成年人解脲支原体DNA检测

目的:为了解未成年人UU感染特点。方法:FQ PCR方法用于定量检测未成年人和成年人样本中的UU DNA。结果:未成年人UU DNA阳性率(28.57%,24/84)显著小于成年人(48.87%,2569/5257)(χ2=13.64,P=0.00022),而UU DNA载量(5.72±1.11)则高于成年人(4.69±1.42)(t=3.54,P=0.00040);未成年女性感染阳性率(31.51%,23/73)显著低于成年人(55.10%,2238/4062)(χ2=16.10,P=6.00E-5),而载量(5.71±1.14)则高于成年女性(5.00±1.52)(t=2.21,P=0.027)。两组男性感染率则无统计学差异(χ2=1.87,P=0.17)。结论:未成年人UU DNA感染率显著小于成年人,UU DNA载量则高于成年人。

冠心病患者外周血单个核细胞HCMV-DNA的荧光定量PCR检测

目的了解冠心病（CHD）患者外周血单个核细胞（PBMCs）人巨细胞病毒（HCMV）-DNA存在情况并探讨其临床意义。方法应用实时荧光定量PCR（real time FQ-PCR）方法,对62例CHD患者,29例其他心血管疾病患者和30例健康体检者的PBMCs内HCMV-DNA进行定量检测。结果 CHD患者PBMCs的HCMV-DNA检出率41.9%,其他心血管疾病组10.3%,正常对照组10.0%,差异有统计学意义（P〈0.05）。CHD组HCMV-DNA载量介于103~105拷贝/ml者为12例,占阳性例数的46.1%（12/26）,介于105~106拷贝/ml者为8例,占阳性例数的30.7%（8/26）。结论 CHD患者PBMCs的HCMV感染可能在其致动脉粥样硬化性发病过程中发挥重要作用。