猪FSP27基因过表达脂肪细胞系的构建与验证

脂肪特异蛋白27(FSP27)是一种新发现的定位在脂滴的蛋白质,在调控脂肪细胞内脂类贮存等方面起着重要作用。本试验用含有猪FSP27基因的慢病毒,感染鼠3T3-L1前脂肪细胞,建立猪FSP27基因过表达的前脂肪细胞系,为进一步研究猪FSP27基因在脂肪细胞中调控脂类代谢提供实验素材。根据猪的FSP27基因序列设计目的基因引物序列,并分别添加酶切位点Nhe I和Age I及保护碱基,克隆到p MD18-T载体做Nhe I和Age I双酶切,将酶切产物回收并将双酶切后的目的片段与GV341载体连接,转入293T细胞,包装成慢病毒,收集、浓缩、纯化病毒上清并用来感染3T3-L1前脂肪细胞,筛选稳定系,并检测感染效率和脂肪细胞表型变化。结果显示,猪FSP27基因过表达3T3-L1脂肪细胞中FSP27基因的相对表达量显著高于对照组(P<0.01),在过表达脂肪细胞培养第8天,脂肪细胞形成脂滴数量明显多于对照组(P<0.05),表明猪FSP27基因过表达3T3-L1脂肪细胞系构建成功。

绵羊Fsp27基因5'-UTR区碱基突变与尾脂沉积能力的关联性

【目的】明确绵羊脂肪特异蛋白27基因(Fsp27)5'端非编码区(5'-UTR)g.16767527位点和g.16767779-16767780位点突变与其尾脂沉积能力的关联性,为低脂肪绵羊品种选育提供理想的分子标记,提高低脂肪绵羊品种改良选育效率。【方法】以5个不同尾脂沉积能力的绵羊品种为研究对象,包括脂尾型绵羊品种阿勒泰羊,短脂尾型绵羊品种小尾寒羊和湖羊,长瘦尾型绵羊品种中国美利奴细毛羊和萨福克羊,采用PCR-SSCP结合基因测序对绵羊Fsp27基因5'-UTR区碱基突变情况进行检测,并分析相关突变与绵羊尾脂沉积能力的关联性。【结果】绵羊Fsp27基因5'-UTR区g.16767527位点为C/A突变,在所检测的绵羊群体中均存在3种基因型(CC、CA和AA),但在不同尾脂沉积能力绵羊品种群体中的基因型频率存在明显差异:阿勒泰羊群体中以CC基因型为主,基因型频率为0.869;小尾寒羊和湖羊群体中以CA基因型为主,基因型频率分别为0.698和0.628;中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体则以AA基因型为主,基因型频率分别为0.616和0.833。g.16767527位点的基因型分布在阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群体中极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态(PHWE<0.01),在萨福克羊群体中显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态(PHWE<0.05)。g.16767779-16767780位点为双碱基突变,对应为GG/GG、GG/TC和TC/TC基因型;在尾脂沉积能力强的阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群体中,g.16767779-16767780位点以TC为优势等位基因,对应的等位基因频率分别为0.862、0.954和0.927;在尾脂沉积能力差的中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体中则以GG等位基因为主,其等位基因频率分别为0.980和0.983。这2个位点的突变均对绵羊Fsp27基因5'-UTR区二级结构产生明显影响。【结论】绵羊Fsp27基因5'-UTR区g.16767527位点的C/A突变和g.16767779-16767780位点的GG/TC突变与其尾脂沉积能力密切相关,可作为分子标记应用于低脂肪绵羊品种的辅助选育。

贵州地方猪脂肪特异蛋白27基因SNPs筛查与生物信息学分析

以3个贵州地方猪种(可乐猪、贵州白香猪、黔北黑猪)为试验素材构建品种DNA池,采用直接测序技术对猪脂肪特异蛋白27(fat-specific protein 27,Fsp27)基因的第4～5外显子区域进行SNPs快速筛查,共检测出4个SNPs位点:intron3-T2169C,exon4-G5A,intron4-G21C和exon5-C5G,其中exon4-G5A和exon5-C5G使编码氨基酸发生Arg→Gln,Thr→Ser的改变。进一步的生物信息学分析显示,exon4-G5A位点的变异导致mRNA的二级结构改变,exon5-C5G多态位点使蛋白质的二级结构发生变化,且当exon4-G5A和exon5-C5G位点的碱基分别为A和G时蛋白质三级结构与其它3种碱基组合(G与G,G与C,A与C)的三级结构明显不同。

Fsp27基因抑制原代肝星状细胞活化与活性的实验研究

目的探讨脂肪特异性蛋白27（fat—specific protein 27，Fsp27）基因对原代肝星状细胞（ hepatic stellate cells, HSCs）增殖活化的影响和对纤维化相关基因的调节作用。方法实时定量PCR检测原代与活化HSCs中Fsp27基因表达。构建携带Fsp27的慢病毒并转染原代HSCs。CCK-8比色法检测Fsp27基因对HSCs增殖的影响。Western blotting检测HSCsd肌动蛋白（α-SMA）的表达，实时定量PCR检测Fsp27基因对HSCs纤维化相关基因表达的影响。结果原代与活化HSCs的Fsp27表达差异有统计学意义（Fsp27mRNA：2700±500，5±2，t=124．27，P〈0．05）。带Fsp27目的基因的慢病毒转染原代HSCs72h后可明显抑制HSCs的活化（66．2±3．8。37．5±4．3，21．7±1．4，F=43．27，P〈0．05）与增殖（48h：31．5±1．3，6．1±0．1，t=17．35，P〈0．05；72h：36．2±2．2，6．2±0．1，t=21．94，P〈0．05）；Fsp27基因促进基质金属蛋白酶2表达（0．48±0．02，0．85±0．14，1．63±0．21，F=41．56，P〈0．05），降低转化生长因子B1表达（3．2±0．17，2．0±0．3，1．7±0．2，F=21．52，P〈0．05）。结论Fsp27基因抑制原代HSCs活化增殖，调节纤维化相关基因的表达，可能与维持HSCs静息状态细胞表型有关。