FVⅢ浓制剂生产工艺的改进

作者于常规制备工艺中增加一步酸沉淀,加上超滤浓缩,可使制品纯度有较大提高。本工艺制备的镧品,在适宜稳定剂保护下,能耐受80℃、72小时的剧烈干热处理。3批小量制备的结果显示制品的平均效价为28.7±2.4μ/ml,平均比活为1.14±0.11u/mg。对冷沉淀抽提液的活性总回收为602以上。热处理制品经3名甲种血友病人初步临床输用观察结果表明安全有效,平均体内活性回收为98.1±31.7％.半衰期为8～12小时。

Met662和Asp1828的Cys突变增强蛋白内含子对共表达的BDD-FVⅢ重链和轻链的剪接

本文旨在通过B区缺失型凝血因子8(BDD-FVⅢ)重、轻链间二硫键形成,改善蛋白质反式剪接效率,提高双载体转BDD-FVⅢ基因功效.将BDD-FVⅢ重链A2区的Met662和轻链A3区的Asp1828突变为Cys,用蛋白内含子融合的重链和轻链基因共转染HEK293细胞,Western印迹检测到细胞内BDD-FVⅢ剪接量的提高以及重、轻链间二硫键的形成,用ELISA和Coatest测得细胞分泌至培养上清的剪接BDD-FVⅢ的量(119±14 ng/mL)和活性(1.06±0.08 IU/mL),明显高于野生型BDD-FVⅢ重链和轻链基因共转染细胞的量(81±12 ng/mL)和活性(0.70±0.15 IU/mL);混合培养的转突变重链和轻链基因细胞培养基中剪接BDD-FVⅢ的量(17±5 ng/mL)和活性(0.15±0.03 IU/mL),与混合培养的转野生型重链和轻链基因细胞(分别为21±9 ng/mL和0.18±0.05IU/mL)相近,反映不依赖细胞机制的蛋白质反式剪接.结果表明,重、轻链间二硫键形成通过增强蛋白质反式剪接提高双载体转BDD-FVⅢ基因的功效.为进一步运用双AAV载体动物体内转BDD-FVⅢ基因提供了实验依据.

腺相关病毒载体血清型8递送的大鼠FVⅢ轻链对不同长度人FVⅢ重链活性的促进作用

目的:研究大鼠FVⅢ轻链(rL C)对不同长度人FVⅢ重链(hHC,包括hHC745和hHC1690)活性的影响。方法:将hHC745、hHC1690、人FVⅢ轻链(hLC)和rL C分别克隆至含CB启动子的腺相关病毒血清型8(AAV8)表达载体中,采用HC和LC共表达的双链策略,转染293T细胞,收取转染后48 h的细胞培养上清;质粒经尾静脉高压注入血友病A(HA)小鼠,注射后48 h通过眼眶采血收集小鼠的外周血血浆。应用活化部分凝血活酶时间(aPTT)法检测FVⅢ的活性,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测FVⅢ的抗原表达量,计算比活性。结果:在293T细胞中,hHC745和hHC1690与rL C共表达时的FVⅢ活性显著高于与hLC共表达时的活性,分别提高到约4.6倍和2.9倍;ELISA结果表明hHC745和hHC1690与hLC和rL C共表达时的FVⅢ抗原表达无统计学差异;根据aPTT测得的FVⅢ活性与ELISA测得的FVⅢ抗原表达量计算的比活性结果显示,hHC745与rL C共表达时的比活性提高到与hLC共表达时的比活性的约4.1倍,而hHC1690与rL C共表达时的比活性提高到与hLC共表达时的约2.8倍。在高压注射的HA小鼠中,hHC745和hHC1690与rL C共表达时的FVⅢ活性显著高于与hLC共表达时的活性,活性分别提高到约5.1倍和2.1倍;ELISA结果同样显示,hHC745和hHC1690与hLC和rL C共表达时FVⅢ抗原表达无统计学差异;比活性结果表明,hHC745和hHC1690与rL C共表达时的比活性较与hLC共表达时的比活性显著提高,分别提高到约4.2倍和1.8倍;hHC1690与rL C共表达时的FVⅢ活性显著高于hHC745与rL C共表达时的活性。结论:rL C可以显著提高不同长度hF VⅢ重链(hHC745和hHC1690)的活性。

前肽缺失体vWF改善FVⅢ基因断裂转移细胞的重链和活性分泌

通过转von Willebrand因子(vWF)的前肽缺失突变体(vWF-ΔPro)基因,探讨了vWF-ΔPro对双载体转凝血VⅢ因子(FVⅢ)基因的影响。将vWF-ΔPro基因和B-区缺失型FVⅢ(BDD-FVⅢ)的重、轻链基因共转染HEK293细胞48 h后,ELISA检测重链的分泌量为(142±29)ng/ml,明显高于未转vWF-ΔPro基因细胞(87±15)ng/ml;未转vWF-ΔPro基因时单独转重链基因的重链分泌水平很低,vWF-ΔPro存在时重链分泌量明显提高,但不如共转基因时的重链分泌,提示轻链可反式促进重链分泌;单独转轻链或与重链共转基因时轻链分泌水平均较高,且不受vWF-ΔPro影响;Coatest法检测分泌的凝血活性显示,转vWF-ΔPro基因可使细胞分泌的凝血活性明显高于未转vWF-ΔPro基因细胞(0.80±0.15 IU/ml vs 0.41±0.08 IU/ml)。另外,转vWF-ΔPro基因条件下,合并培养转重链和转轻链基因细胞的培养上清中,也检测到FVIII凝血活性(0.23±0.09IU/ml),提示vWF-ΔPro有助于分泌的重、轻链形成功能性异源二聚体。表明转vWF-ΔPro基因可促进双链转FVⅢ基因,为进一步动物体内实验奠定了基础。

F VⅢ基因的分子遗传学研究

对若干个不相关个体的FVⅢ基因进行了 4个基因内的RFLPs(BclI、HindⅢ、XbalⅠ、MspⅠ )及几个基因外的RFLPs(TaqⅠ、BstxⅠ、PstⅠ、AccⅠ )的研究 ,计算了FVⅢ基因内多态位点的杂合子频率 ,在内含子 2 2处 ,发现了两个额外的XbalⅠ多态位点。在FVⅢ基因外的DXS5 2区域 ,用探针St14- 1检测到两个TaqⅠ多态系统 ,并计算了杂合子频率。同时观察到在BclⅠ、XbalⅠ。

第三批人凝血因子VⅢ浓制剂国家标准品的协作标定

为更替第二批人凝血因子VⅢ浓制剂国家标准品 ,以WHO 97/ 6 16批重组人凝血因子VⅢ浓制剂国际标准品为对照 ,采用一期法协作标定第三批人凝血因子Ⅷ浓制剂二个候选国家标准品X和Y。并将标准品分别置 4℃、2 2℃、37℃保存 4 .5个月 ,用加速破坏试验进行稳定性考查。结果表明 ,X(2 0 0 10 6 0 6批 )候选标准品效价为 3.8IU/支 ;Y(2 0 0 10 6 0 7批 )候选标准品效价为 7.3IU/支。X批候选标准品比Y候选标准品稳定性好。其它项目均达到国家标准品要求。

凝血因子VIII药品综合评价

血友病A是凝血因子VIII缺乏引起的出血性疾病,凝血因子替代治疗是目前血友病A唯一有效的治疗措施。国内上市的替代治疗药物主要包括重组人凝血因子VIII(重组FVIII)和血源性人凝血因子VIII(血源FVIII)。本文通过检索收集国内上市的7种FVIII相关文献、药品说明书、诊疗指南、官方数据等,根据中国药品综合评价指南从药品基本信息、安全性、有效性、体内药学特性、药品质量、顺应性、经济性七方面对7种FVIII制剂进行综合评价,以期为临床合理用药提供参考。

癌灶内淋巴管侵袭预测直肠癌三站淋巴结转移的意义

目的 明确直肠癌癌灶内淋巴管侵袭同三站淋巴结转移的关系。方法 应用FVⅢ-RAG染色对54例直肠癌扩大根治术切除标本癌灶内的淋巴管侵袭和静脉侵袭加以鉴别和判定,术中清扫的三站淋巴结行常规病理检查。结果 癌灶内淋巴管侵袭阳性组Iy(+)三站淋巴结阳性转移率为27.78％;淋巴管侵袭阴性组Iy(-)三站淋巴结的转移率为2.78％,二组比较有显著性差异(P<0.05)。结论 癌灶内的淋巴管侵袭为预测直肠癌三站淋巴结转移的一个重要指标:

内皮细胞因子TM、vWF、凝血因子Ⅶ、Ⅷ和D-二聚体在肝移植排斥反应变化的研究

目的 为了解肝移植出现排斥反应患者内皮细胞因子、凝血因子和纤溶功能的变化 ,了解这些因素在监测排斥反应、疗效和判断预后的作用。方法 随机观察肝移植 4 1例 ,其中出现排斥反应 1 6例 (急性排斥 1 2例、慢性排斥 4例 )。在术前、术后检测血浆血栓调节蛋白 (STM)、血管性血友病因子 (v WF)、因子 V (FV )、V (FV )和 D-二聚体 (D- D)含量。结果 1有排斥者术前 FVII含量减少 (6 9.2± 7.2 % ) ,D- D含量则升高 (1 .1 9± 0 .2 0 ng/ L) ;2有排斥者术后、排斥前 2天 FVII进一步减少 (分别为 75 .7± 3.1 ,6 0 .7± 4 .5 ) ,而 STM(分别为 5 .5 8± 0 .4 2 m g/ m l,5 .93± 0 .4 5 ng/ m l)、v WF(分别为 1 0 1 .2± 4 .6 % ,1 0 4 .3± 5 .8% ) ;D- D(分别为 2 .89± 0 .75 ,5 .2 8± 0 .81 )则明显升高 ;3急性排斥较慢性排斥 ,冲击治疗无效组与有效组 ,治疗后死亡组与生存组比较 ,STM和 D- D均明显升高。结论 本研究结果初步显示 :1血浆 STM v WF、D- D含量增高和FVII含量减少 ,可作为肝移植排斥早期预报指标 ,其中 STM的特异性最高 ;2血 STM、v WF、D- D和 FVII可作为监测肝移植排斥的实验室检测项目和指标 ;3血 STM和 D- D可作为区分急性与慢性排斥。

宫颈癌组织癌胚抗原及微血管密度表达

目的:探讨癌胚抗原(CEA)在宫颈癌组织中的表达及微血管密度(mcrovessel density,MVD)的改变与临床的关系。方法:采用免疫组化法检测CEA和FⅧ因子(血管性假血友病因子,von Willebrand factor,vWF)在12例正常宫颈、10例宫颈原位癌、40例宫颈鳞癌(SC)、11例宫颈腺癌(AC)组织中的表达。结果:从正常宫颈到原位癌再到侵润癌,CEA阳性表达明显增高(P<0.05),微血管密度亦随之增加,与对照组比较,均有显著性差异(P<0.05);腺癌CEA阳性表达量高于鳞癌(P<0.05)。结论:CEA蛋白高表达和微血管密度的增加,预示着宫颈癌的恶性潜能,可能在宫颈癌发生、进展及组织侵袭中起重要作用。

L303E/F309S突变促进细胞分泌内含肽连接的B区缺失型凝血VIII因子

凝血VⅢ因子(FVⅢ)尽管与凝血V因子具有相似的结构,但其分泌的低效性不仅限制了重组产品在甲型血友病患者中的广泛应用,也困扰基于转FVⅢ基因的基因治疗。为了提高FVⅢ的分泌效率,在我们以前用内含肽(intein)的蛋白质剪接功能介导的双载体转B区缺失型FVⅢ(BDD-FVⅢ)基因研究的基础上,探讨了重链L303E/F309S双突变对剪接BDD-FVⅢ蛋白分泌的影响。PCR突变法将L303E/F309S双突变引入我们以前构建的融合Ssp DnaB内含肽的野生型重链(HCIntN),得到融合内含肽的重链突变基因(DMHCIntN),与融合内含肽的轻链(IntCLC)基因共转染培养的293细胞,用ELISA检测了培养上清中的重链多肽和剪接的BDD-FVⅢ蛋白浓度,用Coatest法分析了培养上清的凝血生物活性。结果显示,单独转DMHCIntN和DMHCIntN与IntCLC共转染细胞上清中的分泌的重链多肽浓度分别为(35±12)ng/ml和(178±19)ng/ml,高于单独转HCIntN细胞和HCIntN与IntCLC共转细胞[(14±6)ng/ml和(127±23)ng/ml];共转DMHCIntN和IntCLC细胞上清中剪接的BDD-FVⅢ蛋白浓度和活性分别为(128±24)ng/ml和(1.01±0.15)U/ml,明显高于共转HCIntN和IntCLC细胞[(90±12)ng/ml和(0.71±0.14)U/ml];另外,单独转DMHCIntN和IntCLC的细胞合并培养后的上清也检测到剪接的BDD-FVⅢ蛋白[(20±3)ng/ml]和活性[(0.17±0.07)U/ml]。结果表明,双突变可提高重链的分泌效率并明显被轻链顺式提高,伴之以剪接BDD-FVⅢ的分泌增加,表明内含肽对双载体转BDD-FVⅢ基因功效的改善并表现出不依赖细胞机制的BDD-FVⅢ剪接作用。为进一步动物体内实验运用内含肽的双AAV转重链双突变BDD-FVⅢ基因研究奠定了基础。

双载体转重链Tyr664Cys和轻链Thr1286Cys突变体BDD-FⅧ基因

用双载体转运凝血Ⅷ因子基因在甲型血友病基因治疗研究中可克服AAV毒载体容量限制,但存在重链分泌低效和链不均衡性问题。为探索重、轻链间二硫键形成对重链分泌的促进作用,该文用双载体转B结构域大部缺失型FⅧ(BDD-FVⅢ)的重链和轻链基因,将重链的Tyr664和轻链Thr1826突变为Cys,研究了HEK293细胞共转基因后的基因表达、分泌至培养上清的重链量和凝血生物活性。用Western blot检测细胞裂解液结果显示,非还原条件下有明显的二硫键交联的重、轻链蛋白;链特异性ELISA定量检测细胞分泌的重链为(125±29)ng/mL,明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞的(75±23)ng/mL;Coatest法显示细胞分泌的凝血活性为(0.78±0.29)U/mL,也明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞(0.34±0.12)U/mL。结果表明,重、轻链间的二硫键形成可提高双载体转FⅧ基因的功效,为进一步在动物体内转基因提供了实验依据。