苦荞FtWRKY28基因克隆及其在低磷与激素诱导下的表达分析

[目的]WRKY转录因子参与植物对低磷胁迫反应的调控。基于前期苦荞在低磷胁迫下的转录组数据,克隆FtWRKY28基因,预测基因及其编码蛋白的序列结构特征,分析基因在各器官中以及在低磷和激素处理下的表达模式、蛋白的亚细胞定位与转录激活活性,为阐明基因的生物学功能奠定基础。[方法]基于苦荞基因组数据库注释设计特异引物,用逆转录PCR从低磷处理的苦荞根RNA样中克隆FtWRKY28的完整编码序列,用生物信息学方法分析基因与蛋白的结构以及同源蛋白的进化关系,用实时荧光定量分析基因的表达模式,用拟南芥原生质体瞬时表达体系分析蛋白的亚细胞定位,用酵母单杂交分析蛋白的转录激活活性。[结果]FtWRKY28的完整编码序列长876bp,编码1个含291个氨基酸、有1个WRKY结构域、锌指结构域为C2H2型的蛋白,归属WRKY家族Ⅱ组。FtWRKY28绝大部分定位于细胞核,具有转录激活活性。FtWRKY28在根中表达水平最高,受低磷、吲哚乙酸、赤霉素3和6-苄氨基嘌呤显著诱导。[结论]FtWRKY28具有转录因子的基本结构与生物化学特征,可能通过生长素、赤霉素、细胞分裂素信号网络的交互作用,调控苦荞在低磷胁迫下的响应过程。

99份苦荞主要农艺性状评价与筛选

为了对苦荞的主要农艺性状进行综合评价,筛选优质苦荞品种,以99份苦荞(国外51份、国内48份)为试验材料,通过变异分析、相关分析和综合得分F值等方法对99份苦荞的11个农艺性状进行分析。结果表明:苦荞11个农艺性状间存在较大变异,变异系数均大于0.1;单株粒重、单株粒数、千粒重和株高与籽粒产量呈极显著正相关;主成分分析显示,前4个主成分的累计贡献率为73.234%,第一主成分中负有最高荷载的为单株粒数和单株粒重;聚类分析将99份苦荞分为6个类群,其中类群Ⅳ的18份品种性状优良,可作为核心种质资源。苦荞选育时应重点考虑单株粒数和单株粒重2个性状指标。综合聚类分析和综合得分F值筛选出23份高产优质苦荞,其中12份为国外引进品种。

苦荞和甜荞查尔酮合成酶基因的克隆及序列比较

以苦荞品种‘西农9920’和甜荞品种‘西农9976’为材料,根据其它植物查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因DNA序列的保守区域设计的一对简并引物,进行PCR扩增,从2种荞麦基因组中克隆出了长度均为860 bp的CHS基因片段,对其进行回收、克隆,挑选阳性克隆测序;序列分析表明这2个片段含有CHS基因的N端和C端的结构域,分别为苦荞和甜荞的CHS基因片段,命名为FtCHS和FeCHS。对获得的2种荞麦CHS基因的DNA序列进行比较分析,发现两者间存在多达43处单碱基多态性,这些单碱基多态性可能是苦荞和甜荞种子中类黄酮含量差异的重要原因之一。苦荞和甜荞CHS与其它植物CHS的氨基酸序列的进化分析表明,其与同为蓼科的掌叶大黄和石竹科的满天星的同源性较近。

磁场对苦荞种子萌发过程中黄酮类物质的诱导效应

研究不同磁场强度诱导下,苦荞种子萌发过程中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮异构酶(CHI)及芦丁降解酶(RDEs)3种关键酶的酶比活力变化规律及与总黄酮含量的关系。结果表明:1)不同磁场强度对同一种酶的诱导效应不同:PAL酶比活力在磁场强度为0.3T时达到最高值;CHI酶比活力最高值出现在磁场强度为0.2T时;当磁场强度为0.3T时,RDEs酶比活力与对照相比无显著性差异;2)相同磁场强度对不同酶的诱导效应不同:强度为0.3T时,PAL酶比活力变化最大;强度为0.2T时,CHI酶比活力变化最大;3)当磁场强度为0.3T时,3种酶的协同作用使苦荞萌发物中总黄酮含量达到最高值(62.90mg/g);实验证实磁场对苦荞种子萌发过程中黄酮类物质的增加具有一定诱导效应。

HPLC法测定荞麦不同种不同部位槲皮素和山柰酚的含量

目的:采用HPLC法测定荞麦不同种不同部位槲皮素和山柰酚的含量。方法:色谱柱:DIKMA diamonsil(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脱;检测波长:260 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:25℃。结果:苦荞不同部位槲皮素含量为:种子(6.12 mg/g)>叶(1.47 mg/g)>茎(0.34 mg/g),根中未检测到;山柰酚只在种子(0.42 mg/g)和西荞1号叶(0.09 mg/g)中检测到;甜荞根(0.12 mg/g)、茎(0.17 mg/g)、叶(0.32 mg/g)和种子(0.12 mg/g)中均检测到较低含量的槲皮素,未检测到山柰酚;苦荞根、茎和叶中的槲皮素和山柰酚总含量和平均含量都高于甜荞;同一产地不同栽培品种苦荞中槲皮素和山柰酚含量差异不大,甜荞未检测到。结论:该方法方便快速,结果准确,可为荞麦及其产品的质量评价提供依据。

苦荞麦的化学成分

目的研究苦荞麦的化学成分。方法利用硅胶S、ephadex LH-20等柱色谱方法分离化学成分,根据理化性质和波谱数据分析鉴定化合物的结构。结果从苦荞麦种子中初步分离得到5个化合物,分别鉴定为乌苏酸(ursolic acid,1)、7-羟基香豆素(7-hydroxycoumarin,2)、大黄素(emodin,3)、尿嘧啶(uracil,4)、原儿茶酸(protocatechuic acid,5)。结论化合物2为首次从荞麦属植物中分离得到,化合物1、5为首次从苦荞麦中分离得到。

鞑靼荞麦离体再生体系的建立

研究了苗龄、外植体、激素配比对鞑靼荞麦(Fagopyrum tataricum Gaertn.)离体培养的影响,初步建立了鞑靼荞麦离体再生体系.结果表明,鞑靼荞麦离体再生的最佳取材时间为苗龄6～8d;诱导愈伤组织的最适培养基为MS+2.0mg/L2,4-D+1.5mg/L6-BA,子叶诱愈率达75%左右,下胚轴诱愈率可高达86.62%;愈伤组织分化的最适培养基为MS+0.1mg/L IAA+2.0mg/L6-BA+1.0mg/L KT+0.5mg/L TDZ,来自下胚轴愈伤组织的分化率可达9.52%.下胚轴的诱愈率与分化率均高于子叶,更适于离体再生培养.培养基中加入AgNO3后,能有效降低褐化率.生根最适培养基为含有0.5mg/L NAA的1/2MS培养基,生根率在50%左右.TDZ在诱导鞑靼荞麦的愈伤组织分化出芽的过程中起到明显的促进作用,可提高分化率约20%.

苦荞麦种子化学成分研究

目的 :分离鉴定苦荞麦种子化学成分。方法 :80 %乙醇提取 ,聚酰胺及硅胶柱色谱分离 ;UV ,IR ,NMR ,MS确定其结构。结果与结论 :分离得到 4个化合物 ,分别鉴定为芦丁、槲皮素、山柰酚、山柰酚 -3 -0芸香糖苷。

四川省凉山州北部栽培苦荞麦的遗传多样性研究

用等位酶电泳技术测定了四川省凉山彝族自治州北部越西和甘洛2县的苦荞麦［Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.］17个栽培居群的遗传多样性和分化，结合农业生物学性状进行了分析。对7个酶系统的15个位点的检测表明，苦荞麦居群内的遗传多样性水平高于该州南部的苦荞麦和其他地区甜荞麦，每个位点的等位基因平均数为1.9，多态位点比率为52.1%，平均实际杂合度和预期杂合度分别为0.190和0.262， FST值为0.199，居群间存在着较明显的遗传分化，接近野生植物的平均水平。对苦荞麦种质资源保护提出了以下策略：“有翅荞”2个居群的多态位点比率P为60.0%，它们的实际杂合度均高于预期杂合度，分别为Ho＝0.260和Ho＝0.301，是遗传多样性最丰富的居群，应重点保护。此外，遗传多样性较高的2个“小米荞”居群和遗传位置独特的“秋苦荞”、“额曲苦荞”和“革洛苦荞”的3个居群也应加强保护。

荞麦种子萌发期多种抗氧化酶活性的研究

通过研究荞麦种子萌发期(0～7 d)超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(ASP)四种抗氧化酶的酶活性变化,以及对自由基等的清除效果,分析荞麦种子内在抗氧化酶系统在萌发期对细胞膜结构的修复及保护作用。实验结果表明:荞麦种子在萌发期产生的活性氧、自由基等对四种抗氧化酶均有激活效应,其中超氧化物歧化酶(SOD)活性最先上升,其他三种酶随其后被激活,四种酶的氧化反应存在一定关联性和协同作用。苦荞的抗氧化酶活性高于甜荞。

苦荞麦中芦丁的正交提取工艺及HPLC检测研究

采用芦丁的最大吸收波长510nm为指标,以索氏回流法进行正交试验;对提取物进行高效液相色谱法检测,结果表明:其最佳工艺参数为乙醇浓度60%vol,乙醇体积150mL,回流时间1.5h,超声时间40min,此条件下芦丁提取率0.95%。

苦荞叶总黄酮提取纯化工艺研究

[目的]合理开发利用苦荞麦生物资源,延伸苦荞产业链,提高其经济效益;探索适合苦荞叶黄酮工业化生产的工艺方法。[方法]以盛花期的苦荞叶为原料,采用超声波辅助法提取总黄酮,并通过大孔树脂吸附法进行纯化,对提取、纯化工艺进行了优化。[结果]总黄酮最佳提取工艺为:以60%的乙醇为提取剂,提取温度为72℃,料液比为1∶32g·mL^(-1),超声波处理时间为31min,超声波功率为101 W,此工艺条件下苦荞叶总黄酮得率为10.2523%;AB-8树脂对苦荞叶总黄酮纯化效果最好,最佳纯化工艺为:上样液pH为5,浓度为1.50g·L^(-1),流速为1.00mL·min^(-1),上样量为33mL·g^(-1)树脂,洗脱液为75%乙醇,洗脱液pH为5,流速为1.50mL·min^(-1),洗脱液用量为10mL·g^(-1)树脂,测得苦荞叶黄酮的回收率为77.01%,黄酮纯度为90.6%,是纯化前的3.02倍。[结论]苦荞叶中总黄酮的含量高,且易纯化;该提取、纯化工艺可满足工业化生产高效益、低成本、简单易操作的需求,为其工业化生产提供理论依据。

苦荞内生真菌产物EE-2抑制HepG2生长及诱导其细胞凋亡

目的研究苦荞内生真菌KQH-2代谢醇提物EE-2对人肝癌细胞的抑制作用及其作用机制。方法采用MTT法考察EE-2对人肝癌细胞HepG2体外增殖的抑制作用,显微镜观察EE-2对HepG2细胞形态的影响,琼脂糖凝胶电泳检测细胞DNA完整性,并利用流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡及细胞周期变化情况。结果用EE-2处理过的HepG2细胞,显微镜观察可见细胞脱壁圆缩,出现凋亡小体;细胞核降解。流式细胞仪检测发现,处理组的DNA直方图上有比对照组加强的SubG1峰,且可将HepG2细胞阻滞于G0/G1期。结论苦荞内生真菌KQH-2代谢醇提物EE-2可诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡,且具有细胞周期阻滞作用。

不同海拔高度对苦荞子粒营养成分的影响

分析了5个苦荞[Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn]品种在湖北省五峰县2个不同海拔高度生态试验点的子粒黄酮、氨基酸和多酚含量变化,旨在为摸索苦荞高效栽培模式,并为选育生态弱响应苦荞新品种奠定基础。结果表明,高海拔种植可提高苦荞黄酮、氨基酸与多酚的含量;相同海拔种植条件下,品种间的黄酮、氨基酸和多酚含量也存在显著性差异,西农9909在2个生态试验点的子粒黄酮含量分别极显著（P〈0.01）和显著（P〈0.05）高于其他品种;与海拔1 400 m种植相比,海拔780 m种植条件下品种间3种营养成分下降幅度均呈现不同程度的变化,其中黄酮含量各品种下降幅度较小,为2.86%~10.53%,多酚含量下降幅度为4.74%~28.57%,氨基酸含量下降幅度最大,为9.52%~77.59%;不同品种对海拔高度变化的敏感性也不同,在供试的5个品种中,SNKQ-1对生态环境因子变化钝感,而云荞2号对生态环境因子变化敏感。

苦荞中抗氧化物质分子结构的波谱学分析

选择超声强化提取法提取苦荞黄酮,采用聚酰胺柱层析和制备薄层层析对苦荞黄酮提取液进行分离纯化,通过抗氧化活性比较,筛选出抗氧化活性最好的样品F3,运用高效液相色谱法、紫外光谱法、红外光谱法、液质联用法、核磁共振法,对样品F3进行结构分析,确定苦荞黄酮的主要成分为木犀草素。

烯效唑浸种对不同水分条件下苦荞生长的影响

以"黑丰一号"苦荞[Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn]为试验材料,采用不同浓度(0、40、80和120mg/kg)烯效唑浸种,探讨不同水分条件(正常供水、中度干旱和重度干旱)下烯效唑浸种对苦荞生长的抗旱效应。结果表明,烯效唑浸种降低了苗高,提高了苦荞的茎粗、叶面积、最大根长和根冠比;同时还提高了叶片相对含水量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量和根系活力。烯效唑处理降低了丙二醛(MDA)含量,从而降低了膜脂过氧化程度,提高了保护酶活性。采用80 mg/kg烯效唑浸种,在正常供水、中度干旱胁迫及重度干旱胁迫条件下,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性较对照均有不同程度的提高;苦荞株穗数、株粒数、百粒重较对照均有不同程度的提高。由此可见,80 mg/kg的烯效唑浸种可以提高苦荞的抗旱能力。

叶面喷施不同浓度硼肥对苦荞主要性状的影响

以西荞2号为试验材料,研究在现蕾期叶面喷施不同浓度硼肥对苦荞(Fagopyrum tataricum Gaertn)主要性状的影响。结果表明,喷施一定浓度的硼肥能有效提高苦荞叶片叶绿素含量、净光合速率、黄酮含量、株高、单株一次分枝数、单株粒数、千粒重;随着叶面喷施硼肥浓度的提高,各指标的大小呈低—高—低的变化,当叶面喷施1.5 g/L的硼肥时,叶片叶绿素含量、净光合速率、黄酮含量、单株粒重和千粒重较对照提高幅度分别为7.14%、83.17%、25.11%、26.13%和15.53%;当硼肥浓度达到2.0 g/L时,对苦荞主要性状有抑制作用,苦荞叶片叶绿素含量、净光合速率、黄酮含量、单株粒重、千粒重等呈下降趋势。

苦荞水提液清除活性氧作用研究

用NBT光化还原法、Fenton反应法和钼酸铵显色分光光度法对苦荞[Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn]叶和茎水提液清除羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(·O2-)和过氧化氢(H2O2)的作用进行了研究。结果表明,苦荞叶和茎水提液具有较强的清除自由基能力,而且随水提液浓度增加其清除能力增强。其中叶的清除能力显著高于茎。

栽培荞麦45S和5S rDNA的染色体物理定位研究

采用双色荧光原位杂交技术,对栽培荞麦甜荞和苦荞有丝分裂中期染色体上的45S和5S rDNA基因物理位置进行了定位分析。结果表明,甜荞有4对45S rDNA位点,位于ⅠS、ⅡS、ⅢL、ⅤL(L和S代表长臂和短臂,罗马数字代表染色体序号,下同);2对5S rDNA位点,位于ⅠL、ⅣS。苦荞有5对45S rDNA位点,位于ⅠS、ⅡS、ⅢL、ⅤL、ⅦS;3对5S rDNA位点,位于ⅠL、ⅣS、ⅥS。甜荞与苦荞的45S和5S rDNA位点具有明显的差异,显示其起源上关系较远。依据中期染色体45S和5SrDNA位点信息及经典核型特征,可以准确鉴别甜荞与苦荞8对同源染色体。

苦荞麦化学成分的药理学作用研究

苦荞麦属蓼科双子叶植物,经济价值和营养价值较高.苦荞麦含有丰富的黄酮类、甾体类、酚类、有机酸类、蛋白质、氨基酸、淀粉以及微量矿质元素等化学成分,对其在降血糖血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳缺血、镇痛抗炎、祛痰、维护血管等药理学作用和苦荞麦资源发展利用方面进行了综述.