GST-Fank1融合蛋白表达载体构建及表达纯化的研究

目的研究转录因子Fank1与GST融合蛋白原核表达载体的构建和表达。方法根据Fank1基因的DNA序列,经引物设计软件Primer Premier 5.0优化设计出上下游引物(Ⅰ,Ⅱ),同时在5′端引入BamHⅠ酶切位点,3’端引入SalⅠ酶切位点。以pdsRED-Fank1质粒为模板进行PCR扩增Fank1目的片段,经限制性内切酶酶切后连接到原核表达载体pGEX4T-2,构建成pGEX4T-2-Fank1原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21(DE3),通过异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导进行目的蛋白表达。结果经菌液PCR、电泳分析及测序证明成功构建了Fank1融合表达载体,融合蛋白产物经蛋白印迹显示,相对分子量为43 kDa的蛋白条带,与预期一致。结论成功构建了pGEX4T-2-Fank1原核表达载体,并在原核细胞中有表达,为进一步研究转录因子Fank1的功能奠定了基础。

人源Fank1蛋白质FN3结构域多肽的原核表达，纯化及晶体筛选

目的纯化人源Fank1（fibronectin type Ⅲ and ankyrin repeat domain1）蛋白质N端FN3（fibronectin typeⅢ，Ⅲ型纤黏连蛋白）结构域蛋白，用于晶体生长的三维结构分析。方法将FN3结构域基因片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中，将菌落PCR和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21（DE3）后获得表达菌株。该菌株经IPTG诱导高效表达出带有GST标签的可溶性的融合蛋白，经过Glutathione Sepha-rose^TM 4B亲和层析、Hiload16／60 superdex200分子筛层析纯化后，蛋白纯度达到95％以上。结果纯化蛋白采用悬滴气相扩散法得到棒状晶体。结论成功制备了高纯度FN3蛋白，获得FN3蛋白质晶体，为进一步的三维结构解析及Fank1功能研究奠定了基础。

小鼠睾丸组织特异基因RNA干扰载体的构建及其表达的研究

目的构建并筛选小鼠睾丸组织特异基因Fank1干扰载体,为进一步研究Fank1基因功能及与Fank1基因相关男性不育的基因治疗奠定基础。方法根据Fank1基因cDNA序列,利用http://www.dharmacon.com/在线设计软件设计2条干扰序列,分别克隆至带有H1启动子的质粒载体pSuper-neo-GFP中,同时从成年B6小鼠睾丸组织扩增Fank1基因全序列,构建Fank1基因与红色荧光蛋白表达融合载体pdsRED-Fank1。采用脂质体法将2个Fank1基因干扰载体及阴性对照分别与Fank1基因表达载体共转染293T细胞,并观察siRNA对Fank1基因的抑制效应及红色荧光蛋白表达情况,分别采用RT-PCR和Western blot方法检测mRNA及蛋白质表达水平。结果经PCR检测鉴定,含干扰序列的重组质粒pSuper-sh Fank1631#,pSuper-shFank1247#及pdsRED-Fank1表达载体构建成功,测序分析完全正确。转染293T细胞36h后,荧光显微镜检查发现shFank1631、247均能明显抑制红色荧光蛋白表达,抑制效率分别为95%和90%,RT-PCR和Western blot结果表明Fank1基因在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制(P<0.05)。结论成功构建出小鼠睾丸特异基因干扰载体,为制备Fank1基因敲减转基因小鼠及研究Fank1基因在精子生成过程中的作用奠定了基础。