Fat-1基因多态性与脊柱结核易感关联性研究

目的寻找和分析与脊柱结核易感性相关的新的候选基因。方法收集2013年6月—2015年12月杭州市红十字会医院收治的脊柱结核患者193例为病例组,同时选取同时期本院体检健康者207例为对照组,采用全基因组外显子技术捕获6例脊柱结核患者外显子区DNA后,进行高通量测序,并结合现代生物信息学方法进行分析,结果初步筛选到Fat-1基因多态性(rs1280098,c.8798A>C,p.Q2933P)与脊柱结核的发生相关;随后,采用Sanger测序法对对照组和病例组患者做上述突变位点的验证。检测Fat-1基因型分布,采用实时荧光反转录聚合酶链式反应(RT-q PCR)法检测Fat-1基因相对表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清白介素(IL)-12和γ-干扰素(IFN-γ)含量,同时检测生化指标。结果病例组AA基因型129例(66.8%)、AC基因型33例(17.1%)、CC基因型31例(16.1%);对照组分别为157例(75.8%)、35例(16.9%)、15例(7.3%)。两组Fat-1基因型分布比较,差异有统计学意义(χ~2=7.885,P=0.019)。不同遗传模型的Logistic回归分析结果显示:在相加模型中,CC纯合突变基因型与脊柱结核是否发病相关,AC杂合突变基因型与脊柱结核是否发病不相关(P>0.05);在显性模型中,AC+CC突变基因型与脊柱结核是否发病相关(P<0.05);在隐性模型中,CC纯合突变基因型与脊柱结核是否发病相关(P<0.05);且该多态性位点最小等位基因C与脊柱结核是否发病相关(P<0.05)。病例组患者外周血Fat-1基因相对表达水平低于对照组,血清IL-12和IFN-γ含量高于对照组,脂蛋白A、C反应蛋白、红细胞沉降率和嗜酸粒细胞计数高于对照组,清蛋白水平低于对照组(P<0.05)。结论 Fat-1基因rs1280098位点多态性与脊柱结核的发病相关。此外,Fat-1基因该位点的突变导致Fat-1基因转录水平下调,以及血清炎性因子IL-12和IFN-γ水平上调,并最终导致脊柱结核易感性增加。这些检测结果为脊柱结核的早期诊断提供了分子依据。

线虫fat-1基因密码子优化设计

本研究旨在优化线虫fat-1基因,使其在牛肌肉组织中高效表达,为进一步生产fat-1转基因肉牛提供目的基因。试验在不改变fat-1基因编码氨基酸序列的基础上,参考了11个牛肌肉蛋白相关基因的密码子使用频率,对fat-1基因进行了密码子优化。结果发现,共改变了65个碱基,涉及65个密码子、7个氨基酸,约占fat-1基因总碱基数的5.38%,G+C含量从45.08%上升到50.04%,且分布均匀利于基因的表达。结构预测结果显示,该优化后的基因能够在牛肌肉中高效表达。

秀丽隐杆线虫fat-1基因密码子优化、克隆及家兔表达载体构建

提取秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)总RNA,采用RT-PCR法扩增出fat-1基因cDNA全长。根据家兔基因密码子使用偏好性,对引自GenBank的fat-1cDNA序列进行密码子优化,通过全基因合成的方法获得优化后的fat-1基因(命名为opfat-1)。将扩增的fat-1cDNA和opfat-1基因分别与pGEM-T Easy和pUC57载体连接,转化大肠杆菌DH5α,获得2种重组克隆子。2种重组子经双酶切后获得的目的片段分别定向克隆入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组表达载体,并对其进行PCR、限制性内切酶酶切分析和测序鉴定,结果表明,成功构建了fat-1基因家兔表达载体pEGFP-opfat-1和pEGFP-fat-1,且读码框正确。

内源性n-3多不饱和脂肪酸对fat-1转基因小鼠血糖血脂的影响

利用fat-1转基因小鼠模型,研究内源性n-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFAs)的血糖血脂调节作用.采用fat-1转基因小鼠和C57BL/6野生型小鼠喂食高n-6、低n-3 PUFAs的标准配方饲料4周,然后2组小鼠给予高糖饮液自由饮用4周,每周测体重.第8周末,取血离心测血糖、胰岛素、甘油三脂(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平.结果表明:fat-1转基因小鼠体重增加幅度、空腹血糖值、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数、血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平明显低于野生型小鼠(P<0.05).认为n-3 PUFAs能抑制体重增长,降低小鼠血糖、血脂和胰岛素抵抗,起到调节血糖、血脂的作用.

影响Fat-1转基因水牛胚胎发育因素的研究

本试验比较了水牛卵母细胞体外受精后注射外源DNA的时间(5～6、9～10、13～14、17～18、21～22 h)和外源DNA的浓度(10、50、100μg/mL)对Fat-1转基因水牛胚胎的发育影响。结果显示,9～10 h组的胚胎表达率和囊胚表达率最高,其中胚胎表达率极显著高于5～6 h组,囊胚表达率极显著高于21～22 h组(P<0.01);在浓度试验中,50μg/mL浓度组的胚胎表达率和囊胚表达率最高,且极显著高于100μg/mL(P<0.01)。

fat-1转基因小鼠的构建与鉴定

目的构建和鉴定携带有外源fat-1基因的转基因小鼠。方法将fat-1基因的cDNA与动物表达载体pEF-neo连接,构建pEF-fat-1重组质粒,酶切、测序鉴定正确后,以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中,并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠,通过PCR、Southern blot杂交等方法确立阳性整合有目的基因的G0代小鼠。结果成功构建了pEF-fat-1重组质粒,将其显微注射到小鼠受精卵中,得到G0代小鼠,PCR、Southern blot杂交确立了4只整合有fat-1基因的首建鼠。结论fat-1基因可整合到小鼠体内,得到的转基因小鼠为研究fat-1基因的生物学功能提供了动物模型。

fat-1基因对结肠癌HT-29细胞增殖的抑制作用

目的探讨fat-1基因在结肠癌HT-29细胞凋亡、增殖以及细胞周期中所起的作用。方法构建真核表达载体(pEGFP-fat-1),用脂质体介导的方法转染到结肠癌HT-29细胞,通过荧光显微镜观察及RT-PCR检测fat-1基因的表达,气相色谱分析检测fat-1基因对HT-29细胞n-6/n-3多聚不饱和脂肪酸(PUFAs)比例的影响,MTT法分析fat-1基因对HT-29细胞增殖的影响,流式细胞术检测fat-1基因对HT-29细胞凋亡和细胞周期的影响。结果成功构建了真核表达载体pEGFP-fat-1,并在HT-29细胞内有效表达。fat-1基因通过降低HT-29细胞内n-6/n-3PUFAs的比例抑制HT-29细胞的增殖,促进其凋亡,细胞增殖主要被阻滞在S期。结论fat-1基因改变HT-29细胞n-6/n-3PUFAs比例后,通过一定的信号转导途径促进大部分HT-29细胞在S期凋亡,抑制了其增殖。

fat-1转基因动物研究进展

转染秀丽隐杆线虫fat-1基因后的哺乳动物具备了将n-6多不饱和脂肪酸(PUFAs)转化为n-3 PUFAs的能力,可降低动物机体的n-6/n-3 PUFAs比例。n-3 PUFAs有益于人类健康,可减少多种相关疾病发生的风险,但人体内不能合成n-3 PUFAs,其必须依赖于富含n-3 PUFAs的食品,fat-1转基因动物将成为人类必需的n-3 PUFAs的重要来源。对fat-1及其转基因动物的研究现状进行综述。

fat-1转基因牛血浆差异蛋白的研究

以fat-1转基因牛血浆蛋白为材料,利用2D-双向电泳、生物信息学及血脂生化检测技术对fat-1基因调控牛脂类代谢的潜在机制进行了研究。结果表明,8个相关差异蛋白(AHSG、KNG1、Serpin A3-1、ENSBTAG00000021729、Serpin A3-5、FAM208A、CTAGE5、LOC511240)被鉴定;经生物信息学预测,发现有63个蛋白与这8个差异蛋白存在互作关系,而且发现差异蛋白和互作蛋白富集了11个与脂类代谢密切相关的生物学通路,其中互作蛋白APOA1在11个通路中富集的频率最高;经血浆APOA1检测发现,转基因牛显著高于野生型牛;相关性分析发现APOA1与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)高度负相关(r=-0.90),与高密度脂蛋白胆固醇/总胆固醇(HDL-C/TC)的比值存在显著正相关(r=0.69)。综合结果显示了fat-1基因可能通过介导APOA1的表达调控转基因牛的脂类代谢。

线虫Fat-1基因密码子的优化及其真核表达载体构建

目的:为使线虫Fat-1基因能够在牛中高效表达,通过密码子优化及全基因合成方法制备Fat-1基因,并构建其转基因表达载体。方法:通过生物信息学手段,将来源于线虫的Fat-1基因以牛为表达宿主进行密码子优化,将优化后的Fat-1基因命名为bFat-1;通过全基因合成方法获得bFat-1基因,构建pcDNA3.1-bFat-1真核表达载体。结果:通过密码子优化,影响Fat-1基因在牛中表达的密码子适应指数、优势密码子频率及GC含量等各项指标均有显著改善;全基因合成、克隆及测序结果显示已获得bFat-1基因;构建并鉴定了pcDNA3.1-bFat-1载体。结论:获得了适合牛体表达的Fat-1基因并构建了其转基因载体,为获得高效表达Fat-1基因的转基因牛细胞系奠定了基础。

人泛素启动子UbB介导Fat-1基因在绵羊成纤维细胞内的表达

旨在构建不饱和脂肪酸脱氢酶基因Fat-1表达载体,实现人泛素启动子UbB调控外源基因Fat-1在绵羊细胞内表达。PCR扩增得到UbB序列,秀丽隐杆线虫Fat-1基因密码子根据绵羊对同义密码子使用偏好性优化后,由公司合成获得oFat-1基因序列,以及pcDNA3.1中的GBHpolyA序列共同插入pCMV-DsRed2-1载体的多克隆位点(MCS),得到重组真核表达载体pUbB-oFat-polyA-CMV-DsRed,载体序列经酶切测序鉴定。线性化的表达载体采用脂质体包裹后转染绵羊成纤维细胞,经G418抗性和红色荧光标记筛选得到阳性细胞,并对阳性细胞进行PCR和反转录PCR鉴定,HPLC检测细胞中不饱和脂肪酸的变化。构建的真核表达载体序列正确,Fat-1基因能够在绵羊成纤维细胞基因组中正常表达,促进细胞ω-6PUFAs向ω-3PUFAs转化,ω-3PUFAs占总量的百分比从11.48%增加到24.41%,ω-6PUFAs的百分比从88.52%下降到75.59%,ω-6PUFAs/ω-3PUFAs比值从7.82±0.18下降到3.10±0.03,差异极显著(P<0.01)。成功构建了UbB启动子介导的Fat-1真核表达载体,筛选得到表达不饱和脂肪酸脱氢酶的绵羊细胞,为进一步制备转基因克隆绵羊奠定了基础。

Fat-1转基因小鼠的研究进展

多不饱和脂肪酸(PUFAs)为人体必需脂肪酸,与人体健康密切相关,其中主要分为n-6和n-3两大类,在哺乳动物中n-6和n-3不能自身合成,只能通过饮食获取。人体内n-6/n-3 PUFAs比例均衡,是人类保持健康的一个重要组成部分。为了研究n-6/n-3 PUFAs的比例在疾病中的预防作用,研究者培育了可自身将体内n-6转化为n-3的fat-1转基因小鼠,解决了以往研究PUFAs只能通过对动物喂养富含n-3和n-6饲料的不便。因而,fat-1小鼠可以作为一种理想的动物模型去研究在不改变饮食结构的状态下,体内的n-6/n-3 PUFAs比例的生物学作用。本文将对fat-1转基因小鼠的研究现状进行综述。

转Fat-1基因体细胞克隆草原红牛研究

Fat-1基因的转基因动物克隆,为研究ω-3多不饱和脂肪酸的功能提供了高效、准确的医学、营养学动物模型。试验成功建立了草原红牛耳部成纤维细胞系,将Fat-1基因转染到草原红牛成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆。以转基因细胞为核供体,体外成熟牛卵母细胞为核受体构建转基因克隆囊胚,比较未转基因与转基因克隆胚胎的体外发育情况。结果表明,体细胞重构胚体外囊胚率分别为26.04%和26.04%,两者之间无显差异著(P>0.05)。转Fat-1基因的草原红牛重构桑葚胚或早期胚胎移植到延边黄牛子宫内,有7头妊娠,但没能够获得妊娠足月个体。

转fat-1基因动物模型和n-3 PUFAs功能作用机理研究进展

研究fat-1基因功能的作用机理对充分合理利用多不饱和脂肪酸(PUFAs)资源具有重要意义,建立转fat-1基因动物模型是了解fat-1基因功能、作用机理的重要方法。文章详细阐述了fat-1基因通过n-3 PUFAs而发挥的生理功能、转fat-1基因动物神经系统疾病模型、转fat-1基因动物肿瘤疾病模型、转fat-1基因炎症动物疾病模型及作用机理研究进展,并对转fat-1基因动物抗肥胖作用机理、转fat-1基因动物在优质家畜育种改良中的作用、利用转fat-1基因动物模型研究骨骼肌发育机理和糖尿病的治疗方法等方面的进展进行了总结,以期为合理利用PUFAs资源和优质家畜改良育种提供理论依据。

Fat-1基因过表达抑制宫颈癌Hela细胞生长机制研究

目的:探讨fat-1基因对宫颈癌Hela细胞生长的影响,并研究PI3K/Akt/mTOR通路是否参与fat-1对Hela细胞生长的调控作用。方法:构建真核表达载体(p-EGFP-fat-1),并转染人宫颈癌Hela细胞,使其过表达fat-1基因,为fat-1组,以转染空载质粒的Hela细胞为阴性对照组,以未经任何处理的Hela细胞为空白对照组。采用气相色谱法检测fat-1基因对ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFA)和ω-6多不饱和脂肪酸(ω-6PUFA)含量的影响;采用MTT和Hoechst实验检测fat-1基因对细胞增殖和凋亡的影响;采用Transwell和细胞划痕实验检测fat-1基因对细胞侵袭和迁移的影响;采用Western blot检测fat-1基因对PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达情况的影响。结果:Fat-1组细胞中fat-1基因表达水平高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)。Fat-1组细胞中ω-3PUFA含量高于空白对照组和阴性对照组,ω-6PUFA含量和ω-6PUFA/ω-3PUFA比例均低于空白对照组和阴性对照组(P均<0.01)。Fat-1组细胞的增殖、侵袭和迁移能力均低于空白对照组和阴性对照组,Fat-1组细胞凋亡水平高于空白对照组和阴性对照组(P均<0.01)。Fat-1组细胞中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表达水平均低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)。结论:Fat-1基因可通过增加细胞内ω-3PUFA含量,靶向作用于PI3K/Akt/mTOR通路,抑制宫颈癌Hela细胞的增殖、侵袭和迁移,促进细胞凋亡。

线虫fat-1基因的原核表达、纯化及其抗体的制备

通过RT-RCR得到线虫f a t-1基因全长,将其N端亲水区克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组质粒pGEX-f a t1-N,将其转化大肠杆菌,并进行诱导表达。对表达产物G ST-f a t1-N融合蛋白进行纯化,制备其抗体,并对抗体效价进行了检测。结果表明,线虫f a t-1基因能在大肠杆菌中表达,制备的抗体能识别在原核表达系统内表达的G ST-f a t1-N融合蛋白,且效价很高,达到1∶107。

fat-1基因密码子优化及在家兔胎儿成纤维细胞中的初步表达

根据家兔基因密码子使用偏好性,对引自GenBank的秀丽隐杆线虫fat-1基因编码序列进行密码子优化,通过全基因合成的方法获得优化后的fat-1基因（命名为opfat-1）;从秀丽隐杆线虫中RT-PCR扩增获得fat-1。将扩增的fat-1和合成的opfat-1基因分别构建到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中。采用脂质体Lipo-fectamineTM转染法将fat-1和opfat-1基因转入家兔胎儿成纤维细胞（Rabbit fetal fibroblast cells,rFFCs）中。对比不同DNA和转染试剂用量以及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间探讨影响rFFCs转染效率的参数,经过优化,最优的rFFCs转染条件为：LipofectamineTM用量2~3μl,DNA量0.8~1.0μg,LipofectamineTM与DNA、细胞共培养时间为8 h。通过绿色荧光标记和RT-PCR检测转染细胞中融合蛋白和目的基因的表达。密码子优化的opfat-1与fat-1相比,体外瞬时表达效率有极为显著的提高;G418抗性筛选获得转基因单克隆细胞,RT-PCR初步验证fat-1和opfat-1基因均在家兔胎儿成纤维细胞中稳定转录表达。

C. elegans fat-1基因对SGC7901细胞的促凋亡作用

目的通过在人胃癌SGC7901细胞系上转入外源C.elegans fat-1基因观其对细胞增殖或对调亡的影响。方法构建携带有能够编码n-3多聚饱和脂肪酸脱氢酶的小秀丽隐杆线虫fat-1基因的重组质粒,转染人胃癌细胞SGC7901,检测n-6/n-3脂肪酸的比例,观察胃癌细胞的增殖和凋亡情况。结果转染成功后携带有fat-1基因的胃癌细胞,显示了对于n-3脂肪酸饱和酶的高表达。脂类分析表明,n-6PUFAs的比例大幅度降低,n-3PUFAs水平明显提高,n-6/n-3脂肪酸比例,从10.45下降到了0.79,尤其是花生四烯酸和二十碳戊烯酸的比率。相应地,在表达有fat-1基因的胃癌细胞中,来源于n-6PUFAs的类花生酸含量有显著减少。同时,fat-1基因的转移导致大量胃癌细胞的凋亡,抑制胃癌细胞的增殖。结论n-3脂肪酸去饱和酶的基因转移,能够有效调整人肿瘤细胞n-6/n-3脂肪酸的比例,起到抗癌作用,证明在癌症的预防和治疗中,n-6与n-3脂肪酸的比例扮演着一个重要的角色。

Fat-1基因在n-3多不饱和脂肪酸功能研究中的应用

n-3多不饱和脂肪酸是机体脂肪酸成分之一,维持体内合理的n-3多不饱和脂肪酸比例具有重要的生理意义。但n-3多不饱和脂肪酸在大多数动物体内不能合成,只能从食物中补充。fat-1基因的出现改变了这一现状,它可以将多不饱和脂肪酸从n-6形式转化为n-3形式。综述了n-3多不饱和脂肪酸的功能,并介绍了fat-1基因的功能及转fat-1基因动物在n-3多不饱和脂肪酸功能研究上的应用。

Fat-1转基因模型小鼠对脂多糖诱导的抑郁样行为和中枢炎症反应的改善作用

以Fat-1转基因小鼠和野生型C57BL/6小鼠为研究对象,经侧脑室注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导中枢炎症模型,测定抑郁样行为糖水偏好度和悬尾实验、腹腔巨噬细胞活性及其吞噬能力、脑炎症小胶质细胞的标记物CD11b基因与蛋白的表达水平,用以研究Fat-1对LPS诱发的炎症和抑郁样行为的作用。结果表明:在野生型小鼠中,LPS降低小鼠糖水偏好度,延长悬尾静止不动时间,增加腹腔巨噬细胞的活性和吞噬能力,上调CD11b基因和蛋白表达水平;而LPS不能引起Fat-1转基因小鼠出现上述类似变化。侧脑室注射LPS可引起野生型小鼠炎症反应和抑郁样行为,而Fat-1转基因小鼠可通过脑内和体内合成n-3 PUFAs抵抗LPS诱发的上述抑郁样变化。