致猪水肿病大肠杆菌鄂E株菌毛F18基因FedF亚基的克隆、表达及其生物学特性

以致猪水肿病大肠杆菌鄂E株为模板,通过PCR的方法扩增大肠杆菌菌毛F18主要亚基FedF的全长及去信号肽亚基因FedFs,扩增片段分别为1000、900 bp。将纯化的扩增产物克隆到pMD18-T中,通过酶切鉴定和序列分析表明,含SacⅠ及HindⅢ酶切位点的基因全长为967 bp,鄂E株FedF基因编码区全长903 bp,编码301个氨基酸,碱基序列同标准株107/86的同源性为100%。与菌毛AF/R1相比,编码的蛋白质没有同源性。利用pGEX-KG分别构建表达载体,SDS-PAGE检测表明FedFc/pGEX-KG无表达带,FedFs/pGEX-KG则有约58 000的特异性表达带;West-ern blotting检测表明重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白GST-FedF免疫新西兰兔所制备的抗血清,能抑制Ee株与刷状缘细胞的粘附。利用表达的蛋白建立了F18的ELISA检测方法,并检测790份临床送检血样,其中536份呈阳性,血清学阳性率为67.8%。结果表明,FedF是猪大肠杆菌病新型疫苗及F18+E.coli感染鉴别诊断的良好候选抗原,通过本试验建立的ELISA方法揭示国内的F18+E.coli感染严重,血清学阳性率高达67.8%。

大肠杆菌野生株F18菌毛蛋白粘附亚单位基因的克隆与表达

根据Z26520中fedF序列设计1对引物,从发病仔猪的腹泻粪便分离获得的大肠杆菌中扩增得到fedF基因,经纯化、连接、转化,将其成功克隆到pMD18-T中,所克隆fedF基因序列与GenBank中收录的其他fedF基因序列的同源性达97.8%～99.2%.另设计1对引物,利用基因工程方法将所克隆的fedF的编码序列亚克隆到表达载体pBV220中,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达重组菌.测序结果表明,插入编码序列与预期序列一致.SDS-PAGE电泳及Western-blotting分析表明,重组菌在诱导后可以表达特异性的相对分子质量为30 100的FedF蛋白.

大肠埃希氏菌F18ab菌毛F亚单位基因的克隆与鉴定

根据已发表的大肠埃希氏菌F18ab菌毛F亚单位 (FedF/ab)的基因 (fedF/ab)序列 ,设计了 1对引物 ,利用PCR技术从大肠埃希氏菌F10 7/ 86、YCED1、YCED2、C、D和 12F株中分别扩增获得了一段序列 ,并克隆至 pGEM T载体 ,获得了重组质粒TF10 7F、TYCED1F、TYCED2F、TCF、TDF、T12FF。经琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析 ,6个重组质粒的大小均为 90 3bp ,与fedF/ab基因大小一致。其中大肠埃希氏菌F10 7/ 86、YCED1、C和 12F株的fedF基因序列完全相同 ;只有YCED2株在第 181位碱基处存在 1个C→T的无义变异差异 ,D株在第 6 5 5位碱基处存在 1个T→C变异差异并在氨基酸水平出现 1个S→P变异。结果表明 。

大肠杆菌F18ac菌毛F亚单位基因的克隆与序列分析

根据已经发表的 F1 8ab菌毛 F亚单位(Fed F/ ab)的基因 (fed F/ ab) ,设计一对引物 ,利用 PCR技术从表达 F1 8ac菌毛的大肠杆菌2 1 3 4P株、81 99株、881 3株中分别扩增到一段序列 ,并克隆至 p GEM-T载体 ,获得重组质粒T881 3 F、T81 99F、T2 1 3 4PF。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明 ,该 3个序列大小均为 90 3bp,与 fed F/ ab大小一致且具有较高的同源性(99.4% ) ,推导的 Fed F/ ac氨基酸序列与 Fed F/ab同源性为 98.3 %。数据表明该实验所克隆的序列均为 F1 8ac菌毛 F亚单位 (Fed F/ ac)的基因 (fed F/ ac)。