An Eperimental Study on the Transplantation of Human Fetal Brain Cells into Monkey Models of Parkinson's Disease.

Unilateral administration of methly-phenyl-tetrahydropyridine(MPTP) into the common carotid artery

牛磺酸对延缓人大脑神经细胞衰老作用机制的研究

采用人胚大脑神经细胞体外无血清原代分离培养方法，研究了不同剂量牛磺酸及不同培养天数对人大脑神经细胞衰老的影响。结果发现：培养神经细胞到第６，９，１５天时，牛磺酸组大脑神经细胞超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的活性均显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）；而加入了不同浓度牛磺酸各组的神经细胞到培养的第６天时，与对照组相比，加入牛磺酸浓度为５０ｍｇ／Ｌ及２００ｍｇ／Ｌ的神经细胞组ＳＯＤ活性均显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）。在培养到第三天时，牛磺酸组脑神经细胞中谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）活性显著高于对照组（Ｐ＜０．０５），培养到第６和第９天时也呈现比对照组增高的趋势。本研究发现随着培养时间的延长，对照组神经细胞膜脂流动性显著下降，而牛磺酸组基本保持稳定；含不同牛磺酸浓度各组的神经细胞，在培养到第６天时，以含牛磺酸５０、２００及４００ｍｇ／Ｌ的神经细胞膜脂流动性较稳定，与对照组相比差异显著（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）。本研究首次证明，适宜剂量牛磺酸对维持神经细胞膜脂的正常流动性是必需的，可显著延缓大脑神经细胞的衰老。

不同胎龄人胎脑皮质颞叶神经干细胞变化特征观察

目的：探讨不同胎龄胎脑皮质颞叶神经干细胞（NSC）的发育规律。方法：收集胎龄为16～36周的水囊引产胎儿90例，采朋免疫组化及光镜技术对人胎脑皮质颞叶NSC的分布、彤态、生长方式以及数量进行检测。结果：NSC主要分布在锥体细胞层及内颗粒细胞层，呈圆形、椭圆形及多角形，尤以小圆形细胞为甚，0～2个突起，核相对较大，1～2个核仁不等，染色质疏松。NSC呈区域性分布，其中有大量由数个细胞形成的NSC集落，少部分NSC以单个彤式存在于其他神经细胞间。各胎龄组间NSC在分布、形态、种类、生长方式等方面无明显差异；随着胎龄的增加，皮质颞叶NSC逐渐减少。结论：不同胎龄人胎脑皮质颞叶NSC在分布、形态、种类和生长方式等方面无明显差异，其数量随着胎龄的增加而减少。

人胎脑发育早期甲状腺激素受体mRNA的表达

目的 动态观察甲状腺激素受体 (TRs)mRNA在人脑发育过程中的表达变化。 方法 用RT PCR半定量法检测 3、5月龄人胎各脑区TRsmRNA表达变化。 结果 3、5月龄人胎大脑、小脑、海马、丘脑、脑干及脊髓均有TRsmRNA表达 ,其中 3月龄胎脑各脑区TRsmRNA表达以TRα1 、TRα2 为主 ,TRβ1 次之。 5月龄胎脑各脑区TRsmRNA表达中以TRβ1 、α2 为主 ,TRα1 次之。TRsmRNA在大脑、小脑、海马处表达相对丰富。实验中发现的与TRα2始终伴行的特异条带经测序证实 ,除在 371 4 12位氨基酸处比TRα2 少 4 2个氨基酸 ,余序列两者完全相同。 结论 在脑发育过程中 ,TRsmRNA呈时空性表达 ,参与调节CNS的分化、成熟。首次验证了人TRα3与TRα2 编码区的差异序列。

LIF对人胎脑神经干细胞体外增殖和分化的影响

目的:观察白血病抑制因子(LIF)对体外培养的人胎脑神经干细胞增殖和分化的影响。方法:用添加表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)的N2培养基培养人神经干细胞(hNSC)。实验分添加LIF(LIF+)组和无LIF(LIF-)组,接种12天后计数细胞集落(球)的形成率。传代培养观察120天,定期进行活细胞计数,绘制生长速率曲线。取第6代细胞球进行分化诱导,免疫荧光技术鉴别神经细胞的特异性抗原标志,并计算各细胞类型间的比例。结果:两组集落形成百分比分别为:LIF+为0.50%-0.91%;LIF-为0.49%-0.94%。两组间的差异并无显著意义(P>0.05)。在相同培养条件下,各例胎脑来源的NSC扩增速率的相差并无显著性意义(P>0.05),但LIF对NSC扩增有重要作用,刺激细胞扩增了约4000-8400倍,无分化发生;LIF-组仅为43-97倍,培养两个月后可观察到分化现象。在培养过程中观察到:LIF的作用主要表现在细胞接种传代约50-60天以后。用免疫细胞化学荧光进行分化细胞类型鉴定,计数神经元和星形胶细胞数,并计算其中神经元所占的百分比。LIF+培养为12%-83%,明显高于LIF-组的8%-23%(P<0.005),来源于海马的NSC分化为神经元的比例要高于来源于纹状体的NSC。结论:LIF能阻抑人胎脑NSC的分化,促进其体外长期增殖,其效应主要表现在接种传代培养的50-60天以后。LIF还影响NSC的分化,可显著提高分化细胞中神经元的百分比,海马源性hNSC对LIF更为敏感。

36周胎龄人胎脑不同部位神经干细胞变化特征研究

目的观察同胎龄不同部位人胎脑神经干细胞(NSCs)的变化特征。方法收集胎龄36周的水囊引产胎儿15例,采用免疫组织化学技术对人胎脑海马、纹状体、室下区、额叶、颞叶、枕叶、顶叶等部位NSCs的分布、形态、生长方式以及数量进行检测。结果36周胎脑海马、纹状体、室下区、额叶、颞叶、枕叶、顶叶等部位均存在NSCs,NSCs呈圆形、椭圆形、星形、多角形及梭形,以圆形及星形多见;细胞0～4个突起不等,胞浆丰富,核呈圆形,染色质疏松,1～2个核仁不等。可见NSCs呈群状、集落样、对称分裂、单个存在等生长方式。海马、室下区、纹状体、额叶、颞叶、顶叶、枕叶等7个部位NSCs逐渐减少。结论36周胎龄不同部位NSCs在分布、形态、生长方式及数量上存在差异。

人胎脑mRNA的差异显示分析及脑表达新ESTs的分离

应用mRNA差异显示技术分析人胎脑组织不同发育阶段及不同部位基因表达的差异并研究其特异表达的基因。以3个锚定引物Oligo（dT）12M（M=A，G，C）及20个随机引物，对脑组织mRNA进行了近50次差异显示分析，共分离出上百个差示产物。对其中部分产物进行克隆、测序获得了39个CDNA序列，长度为100～500bp。其中34个已被Genbank接受并给予新序列编号。

人巨细胞病毒UL55编码蛋白结合蛋白的筛选与鉴定

从人胎脑c DNA文库中筛选和鉴定出与人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)UL55编码蛋白结合的蛋白。将UL55基因编码区克隆到诱饵载体p GBKT7中,在证实UL55蛋白不具有自激活作用的前提下,采用Match-maker GAL酵母双杂交系统筛选人胎脑c DNA文库中与UL55蛋白结合的宿主蛋白,用酵母双杂交回转实验验证UL55蛋白与获得的蛋白结合的可靠性。将酵母双杂交筛选出的文库蛋白烯醇化酶1(enolase1,ENO 1)构建到p GEX-4T-2载体上,利用GST pull-down技术体外验证ENO 1与HCMV UL55蛋白的结合。并依据所筛选出蛋白的生物学功能分析UL55蛋白可能的生物学功能。结果显示有10种蛋白与HCMV UL55编码蛋白结合。应用GST pull-down技术检测到ENO 1与HCMV UL55相互结合的蛋白条带。成功地筛选出10种与UL55蛋白相互结合的宿主蛋白,GST pull-down实验进一步表明ENO 1可以与HCMV UL55蛋白直接结合,为进一步研究UL55蛋白的功能提供了新的线索。

胎脑低分子抑瘤物对白血病细胞作用的研究

目的 :探讨人胎脑低分子肿瘤抑制物对白血病细胞的作用机制及其细胞内游离Ca2 +浓度 ([Ca2 +]i)的变化。方法 :通过超滤技术分段提取胎脑低分子抑瘤物 ,采用光镜、相差显微镜和流式细胞仪检测凋亡 ,Fura 2荧光负荷技术测 [Ca2 +]i。结果 :胎脑低分子抑瘤物可明显抑制K 5 6 2白血病细胞的增殖 ,作用 4h后可出现典型的凋亡改变。白血病细胞凋亡过程中 ,胞内 [Ca2 +]i明显升高。结论 :胎脑低分子抑瘤物可能是通过诱导白血病细胞凋亡而抑制其增殖 ,在白血病细胞凋亡过程中 [Ca2 +]i升高。

人胎儿脑的一个cDNA编码序列及其蛋白质预测

用 m RNA差异显示 PCR技术 ,从人 1 8周、2 2周胎儿脑和肝肾组织的 m RNA逆转录产物得到一些特异性显示的片段 .其中一个随机片段 GC1 0 2作为探针 ,从本实验室构建的 1 8周胎儿脑c DNA基因文库进行杂交筛选 ,得到一个阳性克隆λ gt1 0 /GC1 0 2 .该克隆内插入的 c DNA片段长2 .9kb,经过 DNA测序 ,显示具有一个开放阅读框架 ,编码 1 37个氨基酸的肽链 .用蛋白质结构的建模软件预测了该肽链的立体结构初步模型 .

自噬基因APG5基因结构的生物信息学分析

利用生物信息学手段对一种与人类细胞凋亡有关的基因———自噬基因 (Autophagy 5 ,简称APG5 )的基因组全序列进行拼接和基因结构分析 ,同时该基因的一个新的可变性剪切变异体 (APG5 β)被首次证实及报道。利用PCR技术从人胚脑cDNA文库和B细胞cDNA文库中调取APG5基因 ,装入绿色荧光蛋白pEGFP C1表达载体 ,测序确定其核苷酸序列 ,进行数据库搜索。该基因组全序列分散在核酸序列数据库GenBank的几个不同序列条目中。将相关克隆的基因组序列做相似性比对 ,用DOTPLOT方法确定其相互位置关系 ,并进行序列拼接 ,得到全长基因。利用GenScan、Genefinder等基因识别软件确定其内含子、外显子、转录起始位点、加尾信号等 ,分析其基因结构 ,在此基础上进一步分析其cDNA中外显子数目和排列顺序 ,证实了从B细胞cDNA文库中克隆所得的APG5为一种可变性剪切变异体。利用生物信息学工具 ,成功地拼接出全长为 1 5 0kb人类APG5基因基因组全序列 ,确定其有 8个外显子。根据剪切位点的特性找出其在序列中的位置 ,分别计算出内含子、外显子的长度 ,首次证实并报道APG5 β是第 3外显子缺失的可变性剪切变异体。将验证确实的APG5 β转染至人肝细胞株和HeLa细胞株 ,在共聚焦激光显微镜下可观察到其在细胞凋亡时的特异表达。

人16周胎儿脑cDNA文库的构建及鉴定

本文从 16周的胎儿脑中抽提总 m RNA,经过一系列酶促反应后合成 c DNA,分级分离柱除去小片段 DNA后克隆到λgt10载体中 ,转染宿主菌 C60 0 hfl,文库包装效率为 4 .2× 10 6pfu/μg,得到的原始克隆数为 2 .1× 10 6,c DNA插入片段平均大于 1.2 kpb.根据已知序列设计引物 ,从这个 c DNA文库中扩增出血管内皮生长因子 ( VEGF)的全长 c

人类神经元蛋白 P17.3 全长 cDNA 的克隆及表达特征分析

从人胎脑ｃＤＮＡ文库分离到一个长５９５ｂｐ的ｃＤＮＡ，它含一个编码１５３个氨基酸的完整开放阅读框，５ＵＴＲ长１８ｂｐ，３ＵＴＲ长１１８ｂｐ；在３ＵＴＲ中，含有非典型的加尾信号序列“ＡＡＴＴＡＡＡ”和长１５ｂｐ的ｐｏｌｙＡ序列。由阅读框推导的编码蛋白质的分子量为１７．３ＫＤ，等电点为４．８９。由于它与小鼠神经元蛋白ＮＰ１５．６呈高度同源，尤其是二者的推导氨基酸序列一致性高达８１．２％，故将这一新ｃＤＮＡ序列推导的蛋白命名为神经元蛋白Ｐ１７．３。用ＰＣＧＥＮＥ软件包的ＧＧＢＳＭ程序推导该蛋白质的二级结构，发现该蛋白中３２．６％的氨基酸参与组成α螺旋结构，１５．０％的氨基酸参与组成β折叠片；用位点检测分析软件的ＰＥＳＴＦＩＮＤ程序分析，发现它的第４８～６８位氨基酸残基区为快速衰变蛋白特征性的“ＰＥＳＴ”结构域。

人神经干细胞在宿主鼠脑内分化成神经元呈脑位点特征

目的研究人胎脑神经干细胞植入年幼大鼠脑后的成神经元分化作用,探讨神经干细胞替代治疗小儿脑病的可行性。方法自孕16周的胎脑组织分离培养出神经干细胞球,在小儿脑脊液中培养诱导分化以证明其分化潜能。将培养14 d的神经干细胞球移植10 d龄鼠的侧脑室内,于移植后第4、7、14天杀鼠取脑,切片,行人神经丝特异性标志的免疫荧光分析,显示神经元的分布和细胞形态。结果培养获得典型神经干细胞球,呈漂浮生长,在小儿脑脊液中能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。用抗人神经丝混合单抗检测移植物的成神经元分化,移植后的第4天,观察到阳性反应细胞在颗粒层表现为颗粒性细胞,锥体细胞层则出现长突起的锥体细胞,还有连接神经元样中间神经元,小脑内有单层排列的浦肯野细胞。对比各时间点的观察结果,阳性细胞分布位置未变。随着移植后天数的后延,阳性细胞数量呈减少趋势,但锥体细胞的突起明显加长。结论体外培养获得的人神经干细胞脑室途径移植年幼大鼠,在脑内发生迁移,并分化成形态上与其临近宿主细胞一致的神经元。提示宿主脑组织局部微环境在引导移植物分化成神经元中发挥了重要作用。

酵母双杂交技术筛选人巨细胞病毒UL131A的相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL131A编码蛋白相互作用的蛋白.方法:将成功构建的酵母诱饵表达载体pGB-KT7-UL131A转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA转化到含有pGBKT7-UL131A的酵母细胞中,筛选与HCMV UL131A编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对筛选得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果:成功构建酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL131A,并将其与人胎脑cDNA文库共转化到酵母细胞AH109中,最终确认有23种人胎脑文库蛋白与HCMV UL131A编码蛋白相互作用,其中一种与Thy-1蛋白高度同源,其同源性高达99%.结论:成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL131A编码蛋白相互作用的蛋白,其中Thy-1在HCMV感染致病过程中可能起重要作用.

人胎脑神经干细胞特征性标记物的分布

目的:探讨人胎脑神经干细胞特征性标记物的分布。方法:收集胎龄16-36周水囊引产胎儿90例,采用免疫组织化学和光镜技术对人胎脑不同部位神经干细胞的特征性标记物分布进行检测。结果:不同胎龄胎脑均存在神经干细胞,Nestin和CD34蛋白双阳性NSCs仅存在于28周胎龄组的海马及室下区、32周胎龄组的海马、室下区及纹状体和36周胎龄组的纹状体,且这类NSCs主要呈圆形和椭圆形,大小不一。Nestin和CD133蛋白双阳性NSCs在不同的胎龄组以及同一胎龄组的不同部位其表达不同,胎龄越小,Nestin和CD133蛋白双阳性NSCs越多,32周胎龄组仅在海马部位发现1个此类NSCs,36周胎龄组的任何部位均未发现此类NSCs。结论:Nestin是人胎脑神经干细胞特征性标记物,CD133和CD34是人胎脑部分神经干细胞特征性标记物。

人胎脑皮层神经干细胞的体外培养及鉴定

目的从36周人胎脑皮层分离培养神经干细胞并鉴定。方法采用无血清培养和单细胞克隆技术,从36周自愿水囊引产人胎脑皮层中分离出具有单细胞克隆能力的细胞,并观察神经干细胞体外培养、传代、分化潜能,采用免疫组化和免疫荧光技术检测克隆细胞的神经巢蛋白和各种分化细胞的特征性抗原的表达。结果从36周人胎脑皮层中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续克隆能力,可传代培养,呈Nestin免疫反应阳性;在含血清培养时神经干细胞分化,并表达神经元细胞和星形胶质细胞的特异性抗原。结论36周人胎脑皮层仍能培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞。

细胞癌基因在人脑胚胎发育过程中的表达

作者用分子杂交技术观察了正常4～7月龄胎儿脑的各个部位和正常人脑胚胎发育过程中癌基因的表达。结果显示:多数细胞癌基因的表达水平在小脑和枕叶较高,在颞叶的表达水平较低;人脑组织胚胎发育过程中,c-myc、L-myc、N-myc基因的表达情况类似;erbB基因在胚胎期脑中均有较强的表达,而在正常成人脑中未见其表达;Ha-ras、c-fos基因在人脑胚胎发育的中后期表达水平较高;mos基因在新生儿脑中表达最强。研究结果提示:这7种癌基因可能在人脑的正常胚胎发育过程中起重要作用。

重组人促红细胞生成素与神经疾病

重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoi-etin,rhEPO)目前在临床上主要用于治疗各种原因引起的贫血。大量研究表明,rhEPO除具有造血调节活性以外,还具有强大的神经保护作用。rhEPO对创伤性脑损伤、脑卒中、胎儿和新生儿脑损伤、脊髓损伤、神经病理性疼痛、精神分裂症、视神经损伤等多种神经疾病具有潜在的临床应用前景。该文就近年来rhEPO对以上各种神经疾病作用研究的最新进展进行了全面综述。