甘肃高山细毛羊TLR2基因遗传多态性及其与乳房炎相关性

以286只甘肃高山细毛羊为研究对象,利用PCR-SSCP方法结合测序的方法进行TLR2基因多态位点检测,并通过构建一般线性模型分析其多态性与体细胞评分(SCS)的相关性,以期为甘肃高山细毛羊乳房炎抗性选育提供参考。结果显示,试验群体发现2种等位基因控制的3种基因型(AA、AB、BB),其中B等位基因为优势等位基因,等位基因频率为0.71,而A等位基因频率则为0.29。经χ2适合性检验,突变达到Hardy-weinberg平衡状态(P>0.05)。测序结果与Gen Bank中绵羊TLR2基因序列比对显示,扩增片段分有5处核苷酸多态位点,并导致了3处发生氨基酸改变。AA型个体的SCS均值显著低于AB、BB型(P<0.05),A等位基因基因型可作为乳房炎抗性的优良基因。因此,可将TLR2基因作为甘肃高山细毛羊乳房炎抗感性候选基因应用于乳房炎抗性筛选。

新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

【目的】建立一种高效、实用的新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞原代培养方案,为肾脏损伤引起的疾病研究奠定基础。【方法】取5～8个月大的出栏细毛羊肾脏皮质,剪成1～2 mm3大小组块,分别采用传统组织块法和改良组织块法,在含15%～20%新生小牛血清的DMEM的培养基中进行原代培养,无需研磨或使用酶和化学试剂,根据上皮细胞自身的生长特性,首次结合刮除法,相差消化法和差速贴壁法,分离纯化上皮细胞,再选用0.037 mm孔径网筛过滤除去肾小球上皮细胞,分离纯化培养肾小管上皮细胞,细胞免疫组化进行鉴定。【结果】改良方法与传统方法相比,细胞贴壁早,生长快,处理时间短,减少了污染机率,提高了细胞培养效率,分离培养的肾小管上皮细胞,纯度达90%以上,细胞呈多角形,鹅卵石状,折光性强,连接紧密,可传至第9代,免疫细胞化学(CK-18)染色鉴定为阳性。【结论】改良的组织块培养与传统的组织块培养以及常用的酶消化培养相比,经济、简单、不易污染,分离培养的肾小管上皮细胞,活性高,纯度高,是一种高效、实用的细毛羊肾小管上皮细胞培养方法。

转拟蜘蛛牵丝蛋白基因新疆美利奴细毛羊成纤维细胞系的建立及初步鉴定

[目的]建立含有拟蜘蛛牵丝蛋白基因的新疆美利奴细毛羊成纤维细胞系。[方法]采用脂质体转染,将表达拟蜘蛛牵丝基因的质粒pKap-EGFP4S转入新疆美利奴细毛羊成纤维细胞,通过G418毒性筛选获得阳性细胞系,并采用PCR、RT-PCR检测重组细胞中的目的基因表达。[结果]对体外分离培养的成纤维细胞观察表明细胞形态均为长梭形、活性良好(细胞生长曲线呈S型)、染色体数目为2n=54;通过G418筛选出共43株单克隆细胞系,经PCR鉴定拟蜘蛛牵丝蛋白基因随机整合的细胞系15株,其中挑选4个阳性细胞系经过RT-PCR检测目的基因已转录为mRNA。[结论]成功建立了拟蜘蛛牵丝蛋白基因的新疆美利奴细毛羊成纤维细胞系,为进一步通过体细胞核移植技术制备被毛含转拟蜘蛛牵丝蛋白基因克隆羊奠定基础。

湖羊FecB基因在新疆细毛羊胎儿成纤维细胞中的表达

为培育携带FecB多胎基因的高繁殖率新疆细毛羊,本研究提取了湖羊卵巢的总RNA,在此基础上反转录为cDNA,通过PCR扩增得到了湖羊的FecB基因,再与pMD19-T载体连接,构建了pMD19-T-FecB重组质粒。通过双酶切与真核表达载体pEGFP-N1连接,得到了pEGFP-N1-FecB真核表达载体。经测序与酶切证明,成功构建了pEGFP-N1-FecB真核表达载体,并转染新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,通过药物筛选获得了表达湖羊FecB基因的阳性新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,为培育高繁殖率的新疆细毛羊奠定基础。

敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊DKK1基因的重组质粒,并对其转染成纤维细胞后基因的表达量变化进行研究。试验采集敖汉细毛羊肱二头肌提取基因组DNA,参照GenBank中DKK1基因序列设计1对引物,PCR扩增获得DKK1基因片段,连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-DKK1重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,鉴定正确后构建PmaxGFP-DKK1重组质粒,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞;对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的重组质粒PmaxGFP-DKK1转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测DKK1基因在成纤维细胞中的表达量变化。结果显示,经酶切、测序鉴定发现,重组质粒PmaxGFP-DKK1构建成功,大小为3 956bp,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染细胞后DKK1基因的表达量明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组(P<0.01)。试验成功构建了敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒,并成功转染成纤维细胞,为进一步研究DKK1基因的功能奠定基础。

云南半细毛羊成纤维细胞系建立及其生物学特性分析

实验采用组织块贴壁培养法首次对云南半细毛羊耳缘组织进行体外培养,通过原代培养、传代培养、冷冻保存建立了云南半细毛羊耳缘成纤维细胞系,并对其细胞形态、生长动力学、染色体核型等生物学特性进行分析。结果表明:第7、12、17代细胞群体倍增时间分别为26、42和47 h。细胞生长曲线均为"S"型。云南半细毛羊染色体中正常二倍体染色体(2n=54)所占比例分别为93%、86%和81%,其中,常染色体中有3对为中着丝点染色体,23对为端着丝点染色体,X染色体为最大的近端着丝点染色体,Y染色体为最小的亚中着丝点染色体。染色体组总相对长度197.86,平均相对长度3.66。

基于单细胞转录组测序技术对鄂尔多斯细毛羊次级毛囊形态发生诱导期的研究

【目的】试验旨在解析鄂尔多斯细毛羊胚胎期次级毛囊诱导期形态发生过程中主要细胞类型的分子特征和分化过程。【方法】对采集的3只鄂尔多斯细毛羊(胎龄87 d)体侧部(肩胛骨后缘处)的皮肤样本进行HE染色,鉴定毛囊的发育时期;部分皮肤样本经过混样后进行单细胞转录组测序(scRNA-Seq),应用t-分布随机近邻嵌入(tSNE)分析细胞簇,分别使用胶原Ⅰ型α1链(Col1a1)和角蛋白15(Krt15)鉴定真皮谱系细胞和表皮谱系细胞,并使用皮肤组织不同细胞的标记基因进行细胞类型分析;对测序数据进行拟时序分析,探究其分化过程中差异基因的表达;通过GO功能富集分析进一步验证基因的功能。【结果】HE染色结果发现,鄂尔多斯细毛羊在胎龄87 d处于次级毛囊诱导期。通过scRNA-Seq在胎龄87 d的细毛羊体侧部皮肤细胞样品中获得10603个细胞和18704个基因的scRNA-Seq数据可用于下游分析。tSNE分析发现,皮肤组织中共有15个细胞簇;Col1a 1和Krt 15标记基因鉴定表明,真皮细胞和表皮细胞具有高度异质性。拟时序分析构建毛囊形态发生过程中真皮/表皮细胞谱系细胞的分化轨迹和基因动态表达图谱表明,在真皮谱系细胞由成纤维细胞(Fb)向成熟真皮聚凝物(DC)的分化过程中,多个不同阶段的标记基因FST重组蛋白(Fst)、抑制素亚基βα(Inhba)和转录阻遏物GATA结合1(Trps1)均在拟时序轨道上特异性表达,并富集了Wnt、Noggin和骨形态发生蛋白(BMP)等与毛囊形态发生相关的信号通路;在表皮谱系细胞分化过程中,基质和毛囊间表皮(IFE)的标记基因角蛋白10(Krt10)、同源基因C13(HOXC13)和音猬因子信号(SHH)在表皮谱系细胞拟时序轨道的2个分支上均特异性表达,且富集在细胞增殖和细胞黏附等相关通路。【结论】在细毛羊次级毛囊诱导期,真皮谱系细胞由成纤维细胞分化至真皮聚凝物,表皮谱系细胞处于基质和毛囊间表皮细胞增殖分化阶段,结果可加深人们对细毛羊次级毛囊形态发生过程的了解,为鄂尔多斯细毛羊育种研究提供有力的理论和技术支持。

敖汉细毛羊毛囊细胞系的建立及鉴定

为了研究敖汉细毛羊毛囊细胞的培养方法,建立敖汉细毛羊毛囊细胞系,保存毛囊细胞便于后续细胞水平毛囊相关基因的深入研究,试验采用胰蛋白酶消化法对初生40日龄以内的敖汉细毛羊皮肤组织进行原代培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存、复苏等方式成功分离并纯化出敖汉细毛羊毛囊细胞,然后对细胞进行了形态学观察,冻存、复苏活力检测,生长动力学分析,核型分析和微生物污染检测等分析。结果表明:原代毛囊细胞经胰蛋白酶消化及差速离心分离培养出毛囊细胞,冻存前细胞活力为94.19%,冻存1个月复苏后细胞活力为91.96%。细胞生长呈S型,经历潜伏期、指数生长期和平台期三个阶段。细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。试验成功分离了敖汉细毛羊毛囊细胞并建立了敖汉细毛羊毛囊细胞系。

利用同源重组构建BMP6、BMPR1B真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究

旨在构建敖汉细毛羊BMP6、BMPR1B基因的过表达载体,而后将其导入成纤维细胞,分析转染后两基因mRNA、蛋白表达量的变化及基因间相互作用对毛囊的影响。选择40日龄敖汉细毛羊胎羊,采集组织样品,提取RNA后反转录成cDNA,通过PCR反应后利用SoSo试剂盒将纯化的目的片段与表达载体pcDNA3.1连接。酶切鉴定正确后,转至大肠杆菌DH5α感受态细胞,振荡培养并挑取单菌落扩大培养。提取质粒后将pcDNA3.1-BMP6、pcDNA3.1-BMPR1B单、共转染至成纤维细胞中。转染后测定表达量的变化并探究两基因间的作用关系。结果表明,共转染成纤维细胞后BMPR1B基因及BMPR1B蛋白的表达量均较单转染组极显著升高(P<0.01),而BMP6基因及BMP6蛋白的表达量与单转染组无显著差异(P>0.05)。因此,BMP6基因促进了BMPR1B基因的表达,BMPR1B基因对BMP6基因的表达几乎没影响。

云南半细毛羊毛囊干细胞凋亡研究

采用2种不同方法检测云南半细毛羊毛囊干细胞(hair follicle stem cells,HFSCs)凋亡情况,为后续的诱导分化研究奠定基础。利用凯基TUNEL-细胞凋亡原位检测试剂盒和Annexin V-EGFP/PI标记结合流式细胞仪检测HFSCs凋亡。结果:凯基TUNEL-细胞凋亡原位检测试剂盒检测表明,第2代细胞凋亡率6.0%,第6代细胞凋亡率6.5%;Annexin V-EGFP/PI标记结合流式细胞仪检测表明,第2代细胞凋亡率0.24%,第6代细胞凋亡率0.80%。说明云南半细毛羊HFSCs细胞生长状态很好。随着传代次数的增加,细胞凋亡率有所上升。

云南半细毛羊毛囊干细胞系的建立

【目的】研究云南半细毛羊毛囊干细胞(Hair follicle stem cells,HFSCs)的分离培养方法。【方法】用组织块法原代培养云南半细毛羊HFSCs,并进行细胞纯化和传代培养,培养液为无血清培养液DMEM/F12+40ng/mL bFGF+20ng/mL EGF+20μL/mL B27+100IU/mL青霉素+100IU/mL链霉素。对建立的细胞系进行免疫组化、RT-PCR和流式细胞术鉴定。【结果】HFSCs体积小,为贴壁生长细胞,呈典型的铺路石状,核质比高,在倒置显微镜下胞体透亮、折光性强。RT-PCR分析表明,HFSCs表达K14、K19和β1-integrin,但是不表达CD271和nestin。免疫组化分析结果表明,HFSCs表达K14,不表达CD271。流式细胞术鉴定表明,HFSCs表达K14,阳性率为93.5%;不表达CD271。【结论】建立了云南半细毛羊HSFCs无血清体外培养技术体系。

8个繁殖相关基因在利用羔羊超排技术获得的FecB杂交羊卵巢颗粒细胞上的差异表达分析

家畜的繁殖性状是畜牧业重要的经济性状之一,FecB基因是公认的多胎主效基因。本试验以布鲁拉美利奴羊与新吉细毛羊杂交一代为研究对像,对不携带FecB基因(++型)和携带FecB基因杂合型(B+型)的1月龄母羊超数排卵后,采用手术法进行活体采集卵泡液,收集并培养卵巢颗粒细胞,利用实时荧光定量PCR分析++型和B+型卵巢颗粒细胞上BMPR-1B、BMP15、GDF9、GnRHR、LHR、FSHR、ESR、AMH共8个基因表达情况。结果显示:++型和B+型卵巢颗粒细胞的BMPR-1B、GnRHR、LHR、FSHR基因mRNA表达水平差异不显著(P>0.05);B+型卵巢颗粒细胞的BMP15、AMH基因mRNA表达水平显著高于++型(P<0.05),GDF9、ESR基因mRNA表达水平极显著低于++型(P<0.01),ESR基因mRNA表达水平显著高低于++型(P<0.05)。本试验对利用羔羊超排技术获得的FecB杂交羊卵巢颗粒细胞繁殖相关基因的表达状况进行了分析,进一步明确了利用羔羊超排技术获得的卵母细胞体外成熟阶段的发育环境,为探讨FecB杂交羊对羔羊超排技术的应答机制、优化卵母细胞体外培养技术提供参考。