深海细菌太平洋火色杆菌中α-淀粉酶基因amy608的克隆表达及其酶学性质研究

从来自深海沉积物的太平洋火色杆菌（Flammeovirga pacifica）的基因组中发现了一个全长为1 875 bp的α-淀粉酶基因amy608.该基因在数据库中找不到具有同源性的序列,而所编码的Amy608蛋白与已注册蛋白的氨基酸序列相似性最高仅为56%,但具有α-淀粉酶水解活性所必需的保守基序DXEXD.进化树分析表明其属于糖苷水解酶13（GH13）家族第二亚家族.构建了p ColdΙ-amy608表达载体,在大肠杆菌中进行重组Amy608蛋白的异源表达,并采用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行了纯化.酶学性质分析表明,重组酶Amy608的最适作用温度为40℃,在40℃保温4 d后,仍保留70%以上的酶活,显示出良好的中温热稳定性;最适p H值为7.0,p H值范围在6~9时仍保留60%以上的酶活力,表明该酶具有较宽的p H值作用范围.Ca^2＋、Na^＋、K^＋对α-淀粉酶Amy608有激活作用,尤其是Ca2＋可使酶活显著提高40%.薄层色谱分析结果显示该酶水解可溶性淀粉的最终产物以葡萄糖为主,表明该酶是一个糖化型淀粉水解内切酶.这些结果表明Amy608为GH13家族第二亚家族中一个新型的α-淀粉酶.

深海太平洋火色杆菌琼胶降解基因分析和琼胶酶Aga0950的表达及酶学性质

【目的】对深海太平洋火色杆菌(Flammeovirga pacifica WPAGA1)全基因组进行生物信息学分析,筛选获得琼胶酶基因aga0950,采用基因工程手段对该基因的功能和性质进行验证和分析。【方法】采用Illumina HiSeq2500测序技术进行基因组测序分析;采用克隆表达和镍柱纯化方法获得纯aga0950基因表达产物;采用薄层层析(TLC)和离子色谱(IC)法分析酶降解琼胶产物;采用二硝基水杨酸法(DNS)测定琼胶酶活性。【结果】基因组序列分析表明,菌株WPAGA1全基因组拥有13个β-琼胶酶相关基因;氨基酸序列比对显示,同源性为60%–85%,其中aga0950是具有GH16家族典型特征的基因,同源性为67%。纯化的重组酶Aga0950比活力达51770 U/mg,具有高效降解琼胶活性,降解终产物为新琼四糖和新琼六糖;最适温度为50°C,最适pH为4.0–10.0;Co^(2+)、Mn^(2+)和Fe3+促进酶活,Cu^(2+)抑制酶活。【结论】深海菌株WPAGA1具有丰富的琼胶酶基因;属于GH16家族的琼胶酶基因aga0950表达产物具有高效降解胶琼活性和良好的热、酸、碱稳定性。

深海太平洋火色杆菌琼胶酶Aga2660的克隆表达及发酵优化

【背景】琼胶寡糖已成为化妆品、食品、医药等领域的研究热点,而生物酶法被认为是制备琼胶寡糖的高效方法。【目的】从深海太平洋火色杆菌(Flammeovirga pacifica WPAGA1)筛选获得琼胶酶基因aga2660,对基因aga2660进行克隆转化,使其在大肠杆菌中进行表达,分析重组酶的性质以及酶解产物。【方法】采用克隆表达和镍柱纯化方法获得aga2660基因表达的纯化产物;采用薄层层析和离子色谱法分析酶解产物;5L发酵罐采用补料阶段指数流加、诱导阶段乳糖连续流加的策略进行产酶发酵条件的优化。【结果】基因aga2660是具有GH50家族典型特征的基因,酶解产物为单一的新琼二糖。最适温度为30°C,最适pH为7.0,Mn^(2+)、Ca^(2+)和Mg^(2+)能促进琼胶酶Aga2660的酶活。采用发酵优化策略后的酶活达到11.81U/mL,比优化前提高了13.2倍。【结论】琼胶酶Aga2660具有良好的热、酸、碱稳定性,其酶解产物为单一的新琼二糖,这为特定聚合度琼胶寡糖的制备奠定了良好基础。