HPLC法测定两色金鸡菊提取物中Flavanomarein和Marein的含量

[目的]建立两色金鸡菊提取物中Flavanomarein和Marein含量测定方法。[方法]采用Shim-pack VP-ODS色谱柱（150 mm×4.6 mm,5μm）;流动相乙腈-0.5%甲酸水溶液,梯度洗脱,流速1.0 ml/min;检测波长280 nm;柱温35℃。[结果]Flavanomarein线性回归方程为A=46 609C-205 798,r=0.999 9（n=5）,线性范围为11.788-235.760μg/ml,平均回收率为97.09%（RSD=1.76%,n=9）;Marein线性回归方程为A=8 712.9C-34 542,r=0.999 8（n=5）,线性范围为17.000-238.000μg/ml,平均回收率为98.23%（RSD=0.48%,n=9）。[结论]该方法简单、结果准确,可用于两色金鸡菊提取物中Flavanomarein和Marein的含量测定。

胰岛素抵抗小鼠小肠类器官模型构建及黄诺玛苷对此模型肠黏膜屏障的保护作用

目的构建胰岛素抵抗(IR)小鼠小肠类器官模型,研究两色金鸡菊黄酮类成分黄诺玛苷对肠黏膜屏障的保护作用。方法①构建C57BL/6J和db/db小鼠小肠类器官模型,3D免疫荧光染色观察小肠类器官细胞核核抗原(Ki-67)、上皮细胞E钙黏蛋白(E-cad)、溶菌酶(Lyz)和黏蛋白2(MUC-2)表达,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测纤连蛋白(Fn)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)和肽YY(PYY)mRNA表达;Western印迹法检测Fn,GLP-1和PYY蛋白表达;ELISA检测Lyz分泌水平。②将构建的小鼠小肠类器官分为5组:以C57BL/6J小鼠小肠类器官为正常对照组,db/db小鼠小肠类器官为IR模型组,db/db小鼠小肠类器官用黄诺玛苷25,50和100μmol·L^(-1)处理48 h为IR模型+黄诺玛苷组,RT-qPCR检测各组类器官Lyz mRNA表达,Western印迹法检测Lyz蛋白表达。结果①C57BL/6J和db/db小鼠小肠类器官培养第6天形成管腔结构清晰的环状结构,IR小鼠小肠类器官模型建立成功。3D免疫荧光检测结果显示,建立的小肠类器官均表达Ki-67,E-cad,Lyz和MUC-2;RT-qPCR结果显示,与正常对照组相比,IR模型组Fn mRNA表达显著升高(P<0.05),GLP-1和PYY mRNA表达显著降低(P<0.05);Western印迹法结果显示,与正常对照组相比,IR模型组Fn蛋白表达显著升高(P<0.01),GLP-1(P<0.01)和PYY(P<0.05)蛋白表达显著降低;ELISA结果显示,与正常对照组相比,IR模型组Lyz分泌量显著降低(P<0.01)。②RT-qPCR结果显示,与正常对照组相比,IR模型组Lyz mRNA表达水平显著降低(P<0.01);与IR模型组相比,IR模型+黄诺玛苷50和100μmol·L^(-1)组Lyz mRNA表达水平显著增加(P<0.05,P<0.01);Western印迹法结果显示,与正常对照组相比,IR模型组Lyz蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与IR模型组相比,IR模型+黄诺玛苷50和100μmol·L^(-1)组Lyz蛋白表达显著增加(P<0.05,P<0.01)。结论构建的IR小鼠小肠类器官模型为探讨药物干预修复肠黏膜屏障的病理生理机制提供了更完善的体外研究模型。黄诺玛苷可能通过逆转IR小鼠Lyz表达水平的降低维护肠黏膜屏障,进而发挥改善IR作用。

基于肠道菌群探讨黄诺玛苷对脾虚泄泻小鼠肠道功能的影响

目的基于肠道菌群探讨黄诺玛苷对脾虚泄泻小鼠肠道功能的影响。方法将小鼠随机分为空白组和造模组,造模组采用大黄水煎液灌服结合潮湿环境法建立脾虚泄泻模型;随后造模组随机分为模型组、黄诺玛苷组、阳性对照组,空白组和模型组灌服蒸馏水,给药组分别灌服相应药物。观察小鼠一般体征指标和结肠组织病理学变化,测定炎症因子水平,16S基因测序技术分析肠道菌群,利用1H-NMR技术检测小鼠粪便短链脂肪酸(SCFA)水平。结果黄诺玛苷会上调脾虚泄泻小鼠Bacteroidota、Muribaculaceae、Eubacterium-coprostanoligenesgroup等肠道优势有益菌群的丰度及肠道菌群多样性和丰富度,下调Firmicutes、Proteobacteria、Campilobacterota、Helicobacter、Ruminococcus-torques-group、Colidextribacter等肠道优势有害菌群的丰度,使肠道优势菌群丰度趋于空白组小鼠。肠道优势有益菌群跟脾虚泄泻小鼠血清白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管活性肠肽(VIP)成负相关,与白细胞介素10(IL-10)、胃泌素(GAS)成正相关;肠道优势有害菌群跟之相反。结论黄诺玛苷可能是通过调节脾虚泄泻小鼠肠道微生态平衡,发挥抑制血清和肠道炎症、保护及修复肠黏膜、提升免疫功能、改变肠道SCFA水平作用,有效抑制小鼠脾虚泄泻的发生与恶化。

两色金鸡菊中黄诺玛苷的提取分离及抗血小板聚集作用研究

目的分离和纯化两色金鸡菊中的黄诺玛苷单体,并研究其抗血小板聚集的作用。方法先用55%乙醇回流提取两色金鸡菊干燥花序得到两色金鸡菊醇提物(ethanol extract,ETE),再用乙酸乙酯萃取得到的水层部位为乙酸乙酯萃取物(acetic ether extracted residuum,AR),AR在经大孔树脂富集,并收集75%乙醇洗脱部位得到醇提纯化物(ethanol extract purification,ETEP),ETEP经聚酰胺柱层析分离得到一个黄酮类组分黄诺玛苷单体;静脉采集健康受试者的血液,随机分为空白对照组(0.9%氯化钠注射液)、ETE组(大900μg·mL^-1、中300μg·mL^-1、小100μg·mL^-1剂量组)、黄诺玛苷组(大90μg·mL^-1、中30μg·mL^-1、小10μg·mL^-1剂量组)、阿司匹林(Acetylsalicylic acidsigma,ASA)组(500μg·mL^-1),建立二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、凝血酶诱导的血小板聚集模型。依据Born比浊法,通过血小板聚集的抑制率来观察黄诺玛苷的抗血小板聚集。结果从两色金鸡菊花序中成功的分离得到纯度达到92%以上的黄诺玛苷的单体化合物;抗血小板聚集实验通过和空白对照组相比对ADP诱导的血小板聚集有抑制作用的是醇提物的中剂量组、大剂量组和黄诺玛苷大剂量组,差异具有统计学意义(P<0.01);对凝血酶诱导的血小板聚集有抑制作用的是醇提物的中剂量组和黄诺玛苷中剂量组,差异具有统计学意义(P<0.05);在大剂量醇提物组和大剂量的黄诺玛苷组中,凝血酶诱导的血小板聚集受到抑制,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论从两色金鸡菊中分离得到的黄诺玛苷单体是抗血小板聚集的主要活性物质之一。

雪菊总黄酮抗氧化活性研究

目的:研究雪菊总黄酮及其主要成分的抗氧化活性。方法:对雪菊总黄酮的主成分进行分离鉴定和含量测定,采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2-联氮-二-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)法测试其抗氧化活性。结果:分离鉴定了雪菊总黄酮中的黄诺玛苷、马里苷2个主成分,雪菊总黄酮对DPPH、ABTS自由基的半数清除率依次为11.06、139.3μg·m L-1,与马里苷、黄诺玛苷的半数清除率相近。结论:雪菊精制总黄酮具有优良的抗氧化能力,其中主要含有马里苷、黄诺玛苷等黄酮类活性成分。

两色金鸡菊中马里苷和黄诺玛苷的制备及其均匀性研究

目的从两色金鸡菊中制备黄诺玛苷和马里苷单体,并检测其均匀性。方法称取两色金鸡菊花蕾用55%乙醇回流提取,得到醇提物(Ethanol Extract,ETE),按乙酸乙酯∶ETE(1∶1)萃取,得到乙酸乙酯萃余物(Acetic Ether Extracted Residuum,AR),将AR用正丁醇萃取,得到的有机层经聚酰胺柱洗脱得到黄诺玛苷和马里苷,采用重结晶法纯化,经TLC法进行定性鉴别,采用HPLC法测定含量,经核磁鉴别其化学结构,根据标准样品指导原则检测马里苷和黄诺玛苷均匀性。结果从两色金鸡菊中制备出黄诺玛苷和马里苷,黄诺玛苷和马里苷重结晶之后纯度达到98.4%以上,符合标准样品纯度要求,且制备的黄诺玛苷和马里苷均匀性良好。结论本方法操作简便、工艺稳定,适用于从两色金鸡菊中制备马里苷和黄诺玛苷。

黄诺马苷人工抗原合成及鉴定

目的制备中药两色金鸡菊的活性成分黄诺马苷(Flavanomarein,FM)的人工抗原,为制备FM的单克隆抗体奠定基础。方法利用曼尼希法将FM与多聚赖氨酸(Poly-lysine,PLL)偶联,并采用薄层色谱法进行鉴定,皮下免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA和间接竞争ELISA法对小鼠血清的抗体进行效价与特异性检测。结果薄层色谱结果显示FM与PLL偶联成功;间接竞争ELISA结果显示,采用FM-PLL免疫的3号小鼠产生了抗FM的抗体(Y=-0.037 2 X+0.862 1,R^2=0.969。结论成功合成了黄诺马苷人工抗原,为进一步研究FM的免疫学检测方法提供了实验基础。

基于网络药理学探究黄诺玛苷对非酒精性脂肪肝的降脂作用

目的利用网络药理学探索黄诺玛苷抗非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的作用靶点和信号通路,研究黄诺玛苷治疗NAFLD的作用机理。方法(1)在Swiss Target Prediction数据库中检索黄诺玛苷活性靶点,DisGeNET数据库中搜索疾病靶点,通过化合物靶点与疾病靶点作Venn分析得到黄诺玛苷调节NAFLD脂代谢的预测靶点。借助Biso Genet软件构建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络图,利用Metascape数据库对核心靶点进行GO功能富集与KEGG通路富集分析,用Cytoscape软件绘制"靶点-通路"网络图。(2)采用db/db小鼠模型进行体内实验验证,30只雄性db/db小鼠按随机数字表法分为3组:db/m组(正常)、db/db模型组、db/db+黄诺玛苷组(50 mg/kg)。给药12周后处死,取小鼠肝脏,检测肝脏TG、GSH、GSSG含量,HE和油红O染色观察肝脏病理学变化,qRT-PCR和Western blot检测小鼠肝脏脂代谢的关键mRNA及蛋白的表达水平。(3)HepG2细胞在游离脂肪酸(free fatty acids,FFAs,油酸∶棕榈酸=2∶1)干预成模后,分为正常组、FFAs处理组(500μmol/L)、FFAs+黄诺玛苷低中高浓度组(25、50、100μmol/L),作用24 h。油红O染色检测HepG2细胞内TG的含量。qRT-PCR和Western blot检测HepG2细胞脂代谢的关键mRNA及蛋白的表达水平。结果(1)通过Venn分析,得到黄诺玛苷对接NAFLD的29个核心靶点,主要包括过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)、血管内皮生长因子(VEGF)和丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)等。GO功能富集了6个分子功能、20个生物过程、5个细胞组分。KEGG富集的关键信号通路有40条,主要包括AMPK脂代谢通路、胰岛素抵抗(IR)通路、细胞凋亡通路等。(2)动物实验结果表明,黄诺玛苷能降低db/db模型组TG水平(P<0.05),提高GSH/GSSG比例(P<0.05)。HE和油红O染色显示黄诺玛苷可逆转肝细胞的肿大,减少肝细胞内的脂滴浸润。qRT-PCR结果表明黄诺玛苷可以降低脂质合成基因ACC1、SCD1、FASN mRNA的表达(P<0.05),增强β-氧化基因ACOX-1、CPT1αmRNA的表达(P<0.05)。Western blot结果显示,与db/db模型组相比,db/db+黄诺玛苷组SREBP、FASN蛋白水平显著降低(P<0.05),PPARγ、PPARα蛋白水平显著升高(P<0.05)。(3)体外细胞实验表明,黄诺玛苷可以降低HepG2细胞的TG含量(P<0.05),降低脂质合成基因SREBP、SCD1、ACC1的表达,提高CPT1α、ACOX-1 mRNA水平(P<0.05)。在蛋白水平,黄诺玛苷可以显著降低SREBP、FASN的表达(P<0.05)。结论黄诺玛苷可能通过调节PPARγ/SREBP/FASN信号通路改善氧化应激,增强脂肪酸β-氧化并减少脂质合成,对NAFLD发挥治疗作用。

黄诺玛苷对高糖诱导HUVEC细胞氧化应激及VEGF和ICAM-1蛋白表达的影响

目的观察两色金鸡菊黄酮类化合物黄诺玛苷对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)氧化应激及血管内皮生长因子(VEGF)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)蛋白表达的影响。方法将HUVEC细胞分为正常对照组(NG)、高糖模型组(HG)及不同浓度黄诺玛苷组(50、100、200、400μmol/L)。酶联免疫吸附测定法(ELASA)检测细胞上清液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性。用Western blot方法检测细胞中VEGF和ICAM-1蛋白表达水平。结果与NG组比较,HG组MDA明显升高,SOD、CAT、GSH-Px明显降低(P<0.05或P<0.01)。与HG组比较,黄诺玛苷干预后,MDA含量显著降低(P<0.05),SOD、CAT、GSH-Px活力显著上升(P<0.05)。Western blot结果显示,与NG组比较,HG组VEGF和ICAM-1蛋白表达量增多(P<0.05或P<0.01)。与HG组比较,黄诺玛苷干预后VEGF和ICAM-1蛋白表达量随浓度递增而依次减少(P<0.05或P<0.01)。结论黄诺玛苷可能通过改善氧化应激水平和下调VEGF、ICAM-1的表达对高糖诱导HUVEC损伤具有一定保护作用。

转录组测序分析昆仑雪菊醇提物黄诺玛苷对胰岛素抵抗小鼠小肠类器官的影响

目的:探讨黄诺玛苷对胰岛素抵抗小鼠小肠类器官转录组的影响。方法:首先建立C57BL/6J和db/db小鼠小肠类器官;采用免疫荧光法检测细胞核核抗原(ki-67)和上皮细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达;将小肠类器官分为3组,分别是以C57BL/6J小鼠小肠类器官为正常组、db/db小鼠小肠类器官为模型组和db/db小鼠小肠类器官黄诺玛苷干预组为给药组(FM组);采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测3组小肠类器官胰高血糖素样肽-1(GLP-1)蛋白的表达;并对3组样本进行转录组测序。结果:小肠类器官培养第6天形成围绕管腔周围的环状结构,初步建立了小肠类器官培养模式;免疫荧光检测结果显示小肠类器官均表达ki-67和E-cadherin;Western blot结果显示黄诺玛苷可增加GLP-1蛋白的表达;差异基因表达分析中,模型组与正常组相比差异表达基因共有1862个,FM组与模型组相比差异表达基因共有2282个;通过蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析2组共同表达的差异基因,得到Nr1i3、Cyp2c44、Ugt2b1、Gsta1、Gstm2、Ptgs1、Gstm4、Cyp2c38、Cyp4a32和Gpx310个Hub基因,这些基因在正常组中高表达,模型组中表达降低,黄诺玛苷干预后回调上述基因的表达。结论:黄诺玛苷可能通过逆转Nr1i3、Cyp2c44、Ugt2b1、Gsta1、Gstm2、Ptgs1、Gstm4、Cyp2c38、Cyp4a32和Gpx310个Hub基因的表达水平与相应的信号通路来发挥其改善胰岛素抵抗的作用。

HPLC同时测定雪菊中4种黄酮类成分

目的:建立雪菊中4种主要黄酮类成分的同时含量测定方法。方法:采用Cosmosil-5C18-AR-Ⅱ色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-0.1%乙酸溶液梯度洗脱,流速1.0 m L·min^(-1),检测波长280 nm(黄诺玛苷、异奥卡宁)和378 nm(马里苷、奥卡宁),测定雪菊中黄诺玛苷、异奥卡宁、马里苷、奥卡宁的含量。结果:4种黄酮类成分色谱分离良好,黄诺玛苷、异奥卡宁、马里苷、奥卡宁线性范围分别为0.503 5~5.035μg,0.502 5~5.025μg,0.505 5~5.055μg,0.506 5~5.065μg,r值均>0.999,加样回收率在95.4%~98.4%。结论:该测定方法快速、准确,可为雪菊的质量控制方法提供参考。

黄诺马苷在MDCK单层细胞模型上的转运机制分析

目的:研究黄诺马苷在马丁达比犬肾上皮(MDCK)单层细胞模型上的吸收转运特性。方法:利用噻唑蓝(MTT)比色法考察黄诺马苷对MDCK细胞的毒性,使用Millicell-ERS-2型细胞电阻仪检测MDCK单层细胞模型的电阻值,考察黄诺马苷的质量浓度、给药时间以及钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLTs)抑制剂和葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)抑制剂对其跨膜转运的影响,采用UPLC-MS/MS测定黄诺马苷的含量,计算表观渗透系数(Papp)及外排比(ER)。结果:黄诺马苷质量浓度为5. 625~120 mg·L-1时对MDCK细胞无明显毒性作用,黄诺马苷在MDCK单层细胞模型上的转运具有时间、浓度依赖性,且Papp基本处于1×10-6~10×10-6cm·s-1。在60 min和90 min时,与空白组相比,根皮苷组中黄诺马苷在MDCK单层细胞模型上的转运量显著减少。结论:黄诺马苷在肠道中属于中等吸收的药物,其跨膜转运机制以被动转运为主,兼有主动转运存在,且SGLTs转运体可能参与介导了黄诺马苷在MDCK单层细胞模型上的转运。

马里苷、黄诺玛苷对db/db小鼠肠道菌群的影响及相关性

目的探索两色金鸡菊中黄酮类成分马里苷、黄诺玛苷对db/db小鼠肠道菌群的影响。方法将db/m小鼠作为正常对照组,db/db小鼠分为db/db模型组、db/db+恩格列净(db/db+Empagliflozin)组、db/db+马里苷(db/db+Marein)组、db/db+黄诺玛苷(db/db+Flavanomarein)组,每组8只。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法检测小鼠粪样中Bacteroides ovatus、Ruminococcus gnavus的变化,并运用Pearson检验分析Bacteroides ovatus、Ruminococcus gnavus的变化与2型糖尿病相关表型的相关性。结果(1)干预12周后与db/m组相比,db/db组小鼠粪样中Bacteroides ovatus水平显著降低(P<0.010);恩格列净(P<0.001)、马里苷(P<0.050)、黄诺玛苷(P<0.001)干预后能显著升高其含量,差异具有统计学意义。(2)与db/m组相比,db/db组小鼠粪样中Ruminococcus gnavus水平显著升高(P<0.050);恩格列净(P<0.050)、马里苷(P<0.050)干预后能显著降低其含量,差异具有统计学意义。(3)Bacteroides ovatus水平与空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)呈负相关(r=-0.420,P=0.021;r=-0.474,P=0.008);Ruminococcus gnavus水平与FBG、TG呈正相关(r=0.397,P=0.030;r=0.404,P=0.027)。结论马里苷、黄诺玛苷可以调节小鼠肠道菌群的变化,这可能是其抗糖尿病的重要机制。