布鲁氏菌鞭毛钩蛋白FlgE和融合蛋白BLS-FlgE的克隆、表达及免疫诊断研究

目的分别构建含目的基因flgE和bls-flgE的原核表达载体,表达纯化重组蛋白,并对其免疫诊断价值进行初步评价。方法从NCBI得到布鲁氏菌鞭毛钩蛋白基因flgE和2,4二氧四氢蝶啶合酶基因(bls)序列,设计引物,利用PCR技术扩增得到目的基因,与载体pET30a连接,转化E.coli BL21感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定,使用带His标签的蛋白纯化试剂盒纯化蛋白。纯化后的蛋白建立ELISA法检测布病阳性血清和健康人血清,收集灵敏度和特异度数据。结果成功克隆了FlgE鞭毛钩蛋白和BLS-FlgE融合蛋白,经过优化表达条件,目的蛋白获得较大量的表达,免疫印迹结果显示可被阳性病人血清识别。以FlgE蛋白构建ELISA法检测得到灵敏度和特异度分别为70.83%和41.67%,以BLS-FlgE蛋白构建ELISA法检测得到灵敏度和特异度分别为68.75%和52.08%。结论成功表达布鲁氏菌鞭毛钩蛋白FlgE和融合蛋白BLS-FlgE,分别作为诊断抗原总体符合率低,免疫诊断价值较低。

菊粉对铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗的免疫增强作用

为研究菊粉对铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗的免疫增强作用,本研究将铜绿假单胞菌的flgE基因克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+)中制备DNA疫苗,分别以该DNA疫苗(100μg/只)和菊粉佐剂+DNA疫苗免疫BALB/c小鼠(质粒100μg/只,终浓度20%菊粉),同时设置菊粉灌胃对照组(600 mg/kg)以及灭活疫苗(100μL/只)、鞭毛蛋白(100μL/只)、pcDNA3.1(+)空载体(100μg/只)和PBS对照组(100μL/只)。每两周免疫一次,共免疫3次。利用间接ELISA检测免疫后血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平,双抗夹心ELISA检测IFN-γ分泌情况,计算强毒攻击后各组小鼠的存活数及保护率。结果显示,菊粉佐剂组和菊粉灌胃组小鼠产生的抗体水平与DNA疫苗组相比无明显差异(p>0.05),且显著低于灭活疫苗组和鞭毛蛋白组(p<0.05);菊粉佐剂组对小鼠脾淋巴细胞的刺激值(SI值)和IFN-γ水平与鞭毛蛋白组相当,明显高于菊粉灌胃组和DNA疫苗组(p<0.05);菊粉佐剂组和菊粉灌胃组对小鼠的保护率均高于DNA疫苗组,但低于灭活疫苗组,表明以菊粉预先灌胃和以菊粉为佐剂均可在一定程度上提高flgE基因DNA疫苗对小鼠的保护效率,但仍不及传统的灭活疫苗。本实验为铜绿假单胞菌DNA疫苗的研究及菊粉在DNA疫苗中的应用奠定基础。

基于胞内劳森菌重组flgE蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立以胞内劳森菌(LI)重组鞭毛钩基体复合蛋白flgE为包被抗原的间接ELISA检测方法,本研究将flgE基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a-flgE,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导后获得了可溶性表达的flgE重组蛋白。以纯化的重组flgE蛋白为包被抗原,经优化各反应条件后建立了检测LI抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示所建立的ELISA方法与CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、FMDV、Mhp和APP等阳性血清均无交叉反应。该方法能检测到1600倍稀释的LI阳性血清,批内和批间变异系数均小于10%。利用该方法检测多个不同类型猪场的猪血清(血清来源:2个种猪场1~5胎次的母猪;3个商品猪场30日龄~140日龄的猪;仔猪30头,从30日龄跟踪至80日龄,共采集4次血清),结果显示,母猪和育肥猪的感染率较高可达100%;母源抗体下降后,自50日龄~70日龄起到育肥猪阶段,LI阳性率和抗体水平随着日龄的增长而不断上升;30头跟踪仔猪在单独密闭的饲养条件下,从开始到全群感染LI所需的时间较短(35 d左右)。这些结果与目前已报道的LI血清流行病学调查研究一致,表明该方法能较准确反映LI感染猪的抗体水平。上述结果表明本研究建立的间接ELISA抗体检测方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性,可初步用于临床LI血清流行病学的调查。

铜绿假单胞菌flgE基因PCR检测方法的初步建立

为建立一种基于铜绿假单胞菌flgE基因的PCR检测方法,本试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌flgE基因序列,设计合成了1对特异性引物,由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得了目的基因。从退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度5个方面优化了反应条件,并检测了该方法的特异性和敏感性。结果成功扩增出了铜绿假单胞菌1 400 bp的flgE特异性基因片段,最佳退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度分别为56℃、30个循环、1.6 mmol/L、0.2 mmol/L和0.3μmol/L。特异性试验表明,仅铜绿假单胞菌中可扩增出目的片段,而多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中均未扩增出相应片段。敏感性试验结果表明,本方法可检测到最低10 pg/μL的铜绿假单胞菌基因组DNA以及100 CFU/mL的病原菌。

水稻细菌性条斑病菌中受DSF调控的鞭毛基因flgD、flgE的功能分析

【目的】为了阐明可扩散性信号分子(diffusible signal factor,DSF)调控的鞭毛基因对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)Rs105的致病性等方面的影响。【方法】采用PCR的方法克隆靶标基因flgDxoc和flgExoc,用同源重组法构建缺失突变体,测定突变体及其互补菌株的菌体形态、运动性、致病性及过敏性反应等表型,用反转录PCR(RT-PCR)的方法验证Rs105和ΔrpfFxoc(rpfFxoc基因的缺失突变体,不产生DSF)中flgDxoc、flgExoc表达量的差异。【结果】从Rs105基因组中克隆到flgDxoc、flgExoc基因,并证实这两个基因在基因组中均为单拷贝。PCR和Southern杂交结果显示,flgDxoc、flgExoc基因被成功敲除。与野生型相比,突变体的鞭毛产生能力丧失,游动性和趋化性能力减弱,接种水稻叶片显示其致病性部分减弱,基因互补可使其恢复。生长能力和对烟草叶片的致敏性无明显改变。RT-PCR结果显示,flgDxoc、flgExoc基因在ΔrpfFxoc中的转录水平明显降低。【结论】本试验表明:FlgD、FlgE是水稻细菌性条斑病菌鞭毛形成所必需的因子;进一步证明了DSF通过调控flgDxoc、flgExoc基因表达,从而影响条斑病菌的致病性等表型。为深入认识DSF对细菌性条斑病菌鞭毛基因簇的调控提供了科学依据。

绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的重组表达及初步活性鉴定

目的原核表达及纯化绿脓杆菌鞭毛蛋白ngE并进行初步活性鉴定。方法分析绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的基因序列，设计带适当酶切位点的引物，用PCR方法扩增出FlgE的编码DNA序列，与大肠杆菌表达载体pET24a同时经NdeI／Hind Ⅲ双酶切、纯化及连接后构建pET24a—FlgE原核表达质粒，挑选重组阳性质粒经DNA测序确认序列正确，转化至大肠杆菌B121中进行诱导表达条件优化，使重组质粒表达目的蛋白，采用组氨酸标签亲和层析法对目的蛋白进行纯化，通过SDS-PAGE对纯化后蛋白相对分子质量进行鉴定，用试剂盒进行去内毒素化处理。在体外培养人角膜上皮细胞系细胞，加入纯化的F1gE重组蛋白，培养4h后应用实时定量PCR检测各种相关的炎性因子以反映FlgE蛋白活性。结果可用于大肠杆菌表达系统的重组pET24a—F1gE构建成功，其编码的蛋白在BL21中获得高效表达，当诱导剂异丙基一B—D一硫代吡喃半乳糖苷浓度为1mmol／L，在16、225r／min振荡培养20h，诱导目的蛋白表达量最高，经纯化、去内毒素处理和SDS—PAGE鉴定，获得纯化的重组FlgE蛋白。角膜上皮细胞用20μg／ml FlgE处理后，细胞内炎性相关分子IL-6和IL-8的表达量明显上升，而灭活的F1gE蛋白则丧失该刺激活性。结论获得纯化的重组绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE，且可刺激角膜上皮细胞上调炎性因子IL-6、IL-8的表达。

铜绿假单胞菌flg E基因壳聚糖纳米DNA疫苗的免疫效果评估

为评价铜绿假单胞菌flgE基因壳聚糖纳米DNA疫苗的免疫效果,本研究经PCR扩增flgE基因,将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建flgE基因的重组质粒pflgE,进一步以壳聚糖为佐剂制备了纳米DNA疫苗CpflgE,通过测定OD260nm值检测纳米DNA疫苗的包封率、加入DNA酶后经琼脂糖凝胶电泳检测其抗DNA酶降解的能力、37℃恒温静置1 d,3 d和5 d后经琼脂糖凝胶电泳检测稳定性。结果显示CpflgE的包封率为94.69%,可有效抵抗DNaseⅠ的降解,具有较强的稳定性。以pflgE和CpflgE免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,同时设置灭活疫苗免疫组、铜绿假单胞菌鞭毛蛋白亚单位疫苗免疫组以及PBS对照组。免疫后不同时间经间接ELISA测定各组小鼠血清抗体水平,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平,采用检测试剂盒测定各组小鼠血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的水平。结果显示,Cpflg E诱导小鼠的血清抗体水平、脾淋巴细胞增殖水平及血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的浓度总体上虽均低于灭活疫苗,但与鞭毛蛋白亚单位疫苗相当,且显著高于pflgE (P<0.05)。三免两周后以铜绿假单胞菌强毒株(1.35×10^(10)cfu)对各组小鼠进行攻毒试验,测定攻毒后各组小鼠的保护率,结果显示,pflgE组、CpflgE组、鞭毛蛋白疫苗组和灭活疫苗组的保护率分别为57.1%、76.2%、81%和95.2%。本研究首次证实壳聚糖作为载体和佐剂可以显著提高铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗诱导的免疫应答水平,为铜绿假单胞菌新型DNA疫苗的研制提供了参考依据。