补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血后血管内皮生长因子及其受体Flk1的影响

目的探讨补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血后血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(Fetal liver kinase1,Flk1)的影响。方法大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组、补阳还五汤组,大脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血模型,采用免疫组织化学法和酶联免疫法检测各组动物脑内VEGF、Flk1的表达和蛋白水平,同时评价动物神经功能。结果在正常大鼠脑内有少量VEGF和Flk1阳性细胞,脑缺血后VEGF和Flk1阳性细胞增加;与模型组比较,尼莫地平、补阳还五汤均能改善模型大鼠的神经功能缺失症状,增强VEGF和Flk1的表达,提高VEGF蛋白水平(P<0.05);于7、14d补阳还五汤作用强于尼莫地平(P<0.05)。结论补阳还五汤增强大鼠局灶性脑缺血后VEGF及Flk1的表达和提高VEGF蛋白水平,是其抗脑缺血的可能作用机制之一。

慢性粒细胞性白血病患者骨髓源bcr/abl融合基因阳性Flk1^+CD31^-CD34^-干细胞体外抗STI571机制的初步研究

为进一步了解STI571对慢性粒细胞性白血病(CML)患者体内bcr/abl融合基因阳性的原始及定向白血病干/祖细胞分化及增殖的影响,更深入阐明部分CML患者在经历一段血液学甚至是细胞遗传学水平上的完全缓解后复发及对STI571的耐药机制,利用从CML患者骨髓分离到的具有血管母细胞特性、bcr/abl融合基因阳性、免疫表型为Flk1+CD31-CD34-细胞,体外检测了STI571对其在造血集落培养基中的分化及处于分化阶段时的增殖抑制作用。结果显示:浓度为5μmol/LSTI571,维持作用96小时(病人体内维持96小时的STI571浓度只可能达到1-2μmol/L),即可有效抑制定向造血祖细胞的增殖。没有充分的证据显示,相对原始的bcr/abl融合基因阳性、免疫表型为Flk1+CD31-CD34-细胞的分化及增殖受到明显的抑制作用。结论:CML患者体内的原始白血病干/祖细胞对STI571具有一定的抗性,临床上所观察到的CML患者在运用STI571一段时间后出现正常的造血恢复现象,可能仅仅是因为STI571杀死或抑制了定向恶性白血病祖细胞的增殖,但随着时间的推移,在经历了短暂的血液学甚至是细胞遗传学水平上的缓解后,对STI571耐药的原始白血病干/祖细胞终究会再次导致CML的复发。

CD105和Flk1在尖锐湿疣组织中的表达

目的:研究CD105和Flk1(fetal liver kinase-1)在尖锐湿疣(condyloma acuminatum,CA)组织中的表达及其可能作用。方法:采用鼠抗人CD105单克隆抗体和兔抗人Flk1多克隆抗体,应用免疫组化方法检测CD105和Flk1在27例CA组织和17例正常包皮组织中的表达。结果:CD105在血管内皮细胞膜上表达,CA组织中CD105标记的血管数比正常包皮组织明显增多,有显著差异(t=10.601,P<0.001);Flk1在CA组织的角质细胞胞浆和血管内皮细胞膜上均有表达,而正常包皮组织中仅在角质细胞胞浆呈弱表达,差别也有显著意义。结论:CD105和Flk1在CA组织中有过度的表达,可能与血管生成有关。

黄芪提取物对心肌梗死大鼠心肌组织中VEGF/Flt1/Flk1的表达分析

目的研究黄芪提取物(Astragalus Extract,AE)对心肌梗死大鼠心肌组织中VEGF及其受体Flt1/Flk1的表达调控作用,探讨黄芪促血管新生作用机制,为心肌梗死的治疗提供理论和实验依据。方法通过结扎大鼠心脏的左冠状动脉前降支造成心肌梗死的模型,然后将大鼠分为模型组、AE低剂量组(10 mg·kg^(-1)·d^(-1))、中剂量组(20 mg·kg^(-1)·d^(-1))、高剂量组(40 mg·kg^(-1)·d^(-1)),另外再设假手术组,仅仅穿线而不结扎。各组大鼠数量为8只。各治疗组给予AE上述对应的各药物剂量灌胃(ig)给药,模型组及假手术常规饲养,饲养4周后,把大鼠处死。应用HE染色、Masson染色分析左心室心肌细胞组织形态学变化和血管结构病理成分变化;反转录PCR(RTPCR)法测定心肌组织中VEGF、Flt1、Flk1 mRNA的表达变化;免疫组化染色法和免疫印迹法分析心肌组织中血管内皮生长因子VEGF、Flt1、Flk1的蛋白表达变化。结果 HE染色分析,模型组大鼠心肌细胞坏死严重,成纤维细胞增生较多,并伴有炎性浸润;AE低、中剂量组大鼠,心肌细胞形态结构不清晰,排列不齐,炎性浸润略微;AE高剂量组的大鼠心肌细胞形态结构完整,有效降低成纤维细胞的增生。与模型组比较,AE各组大鼠心肌组织结构相对规整,胶原含量明显下降(P<0.05),新生的血管数量明显增(P<0.05),内皮细胞形态相对完整,VEGF及Flt1、Flk1 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。结论 AE可明显改善大鼠心肌梗死后心肌组织的紊乱状态,促进受损心肌组织中新生血管数量的增加,提高受损心肌组织中VEGF、Flt1、Flk1 mRNA和蛋白的表达。

非小细胞肺癌survivin和Flk1表达及关系分析

目的:观察survivin蛋白和血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体FIk1在不同病理类型及不同临床分期的非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)中的表达规律并探讨其相互关系。方法:采用临床NSCLC患者病理标本进行研究,NSCLC组为56例非小细胞肺癌肿瘤病理标本,患者临床资料分类中,临床Ⅰ期15例、Ⅱ期28例、Ⅲ期13例,病理分级分类中高分化肿瘤16例、中分化肿瘤22例、低分化肿瘤18例,对照组为18例癌旁组织。采用SABC法进行survivin蛋白和FIk1蛋白表达的免疫组织化学检测,分析染色结果确定阳性和阴性。结果:56例NSCLC中44例survivin表达阳性,survivin阳性率为78.6%(44/56),显著高于癌旁组。survivin阳性表达在不同NSCLC肿瘤病理分级中相差显著,在不同临床分期、不同淋巴结转移中显著不同。56例NSCLC中42例FIk1表达阳性,占75.0%(42/56),显著高于癌旁组。FIk1阳性表达在不同NSCLC肿瘤病理分级中相差显著,在不同临床分期、不同淋巴结转移中显著不同。NSCLC中survivin与FIk1阳性表达显著相关。结论:Survivin和FIk1共同高表达与NSCLC发生发展及浸润转移有显著关系。

利用谱系示踪研究小鼠胚胎发育早期的Flk1^+细胞

目的:了解中胚层来源的Flk1^+细胞在小鼠胚胎发育早期不同部位的分化情况,进而探索Flk1^+细胞是否在血管发育过程中有分化为周细胞等间质谱系的潜能。方法:基于Cre-LoxP系统的条件型基因敲除研究策略,利用Flk1-Cre小鼠和ROSA26报告小鼠进行谱系示踪研究。用GFP^+群体示踪Flk1^+细胞群体的命运。结合中胚层标志Flk1,造血细胞特异性标志CD45,内皮细胞特异性标志CD31、CD144以及Emcn(endomucin),周细胞特异性标志PDGFRβ和NG2,利用免疫组织化学、免疫荧光等组织检测和流式细胞术探究所关注的问题。结果:对谱系示踪小鼠Flk1-Cre;ROSA26-EYFP在胚胎发育早期不同部位的免疫组化结果显示,在背主动脉、肢芽及卵黄囊等多处造血位点周围Flk1^+细胞来源的GFP^+群体中,观察到除了造血细胞、沿血管壁特异性分布的CD31^+/Emcn^+典型内皮细胞外,还有间质样细胞等多种类型的群体。组织学研究显示这群表达在血管周围的既非造血又非内皮的细胞是周细胞。流式细胞术分析也证实,Flk1^+细胞贡献了周细胞。此外,在如背主动脉、肢芽等部位造血位点周围的GFP^+群体中还观察到小部分形态为间质样的CD31^+CD140B^+细胞群体。结论:在胚胎发育早期,中胚层来源的Flk1^+群体不仅贡献了造血、内皮、以及肌肉等谱系,还贡献了包括周细胞在内的间质谱系。推测观察到的CD31^+CD140B^+细胞群体可能是由Flk1^+祖细胞分化而来的内皮细胞,正经历着内皮间质转化EndMT,逐渐丢失内皮表面特异性标志,同时也开始表达周细胞表面标志。

脐带华通胶间充质干细胞向Flk1阳性细胞分化的研究

目的:诱导脐带华通胶间充质干细胞向Flk1阳性细胞分化。方法:胶原酶法分离培养脐带华通胶间充质干细胞,第3代细胞以含2-巯基乙醇的分化培养基培养,应用RT-PCR和流式细胞仪从mRNA和蛋白水平检测Flk1阳性细胞分化水平。结果:脐带华通胶间充质干细胞Flk1mRNA及蛋白表达极低,分化培养基培养后表达上调,48h达高峰(P<0.05),之后表达降低。结论:2-巯基乙醇可诱导脐带华通胶间充质干细胞向Flk1阳性细胞分化,为从中分选Flk1阳性细胞进行进一步研究提供了依据。

血管内皮细胞发育及分子机制

心血管系统是胚胎发育中最先形成的器官之一,为机体提供营养成分和氧气。血管发育包括两部分,一是内皮祖细胞(Angioblast)聚集形成血管原基(Vasculogenesis),二是从已有血管形成新的血管分支(Angiogenesis)。此后由初级内皮细胞管召集平滑肌细胞形成功能性血管(Vessel maturation)。内皮祖细胞起源途径包括:由Flk1阳性中胚层细胞到成血成血管细胞(Hemangioblast)到血管内皮祖细胞;或由Flk1阳性中胚层细胞直接到血管内皮祖细胞。Flk1阳性中胚层细胞受到vegf、flk1、cloche、lycat、etsrp等关键基因或信号通路的调节,其中核心问题是原肠期中胚层如何形成Flk1阳性中胚层细胞及进一步分化成血管内皮祖细胞和成血血管细胞。文章集中评述内皮祖细胞发育、分化及其分子遗传调控机制,并展望本领域未来发展方向。

血管内皮生长因子2型受体胞外1～3区核酸疫苗的构建及对H22肿瘤生长的抑制作用

背景与目的:大多数实体肿瘤的生长转移都需要新生血管的支持,血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在肿瘤的血管生成中居中心地位,而flk1(fetalliverkinase1)是VEGF发挥作用的关键。阻断VEGF同flk1的结合可望达到抑制肿瘤生长的目的。我们构建了小鼠flk1胞外1～3区核酸疫苗,并检验疫苗对肝癌细胞H22小鼠移植瘤生长的抑制作用。方法:RT-PCR法克隆flk1胞外1～3区基因片段,将片段插入质粒pcDNA3.1(+),构建核酸疫苗pcDNA3.1(+)-flk1-Domain1-3;脂质体转染COS7细胞,Westernblot法检测flk1-Domain1-3的真核表达;采用标准4h51Cr释放实验检验疫苗免疫小鼠特异性CTL。30只小鼠分为疫苗接种组,pcDNA3.1(+)接种组和生理盐水接种组。股四头肌肌肉丰厚处接种10天后再皮下接种H22细胞,记录肿瘤的生长情况、体积、湿重、微血管密度、小鼠死亡时间,观察疫苗对小鼠H22皮下移植瘤生长的抑制作用。结果:PCR扩增出1252bp大小的基因片段,测序证明所获基因序列阅读框架与GenBank所公布的flk1胞外1～3区一致。Westernblot显示转染疫苗的细胞中有分子量约为44kDa的蛋白表达,与flk1胞外1～3区蛋白大小一致;51Cr释放实验提示,疫苗可引起针对内皮细胞的特异性CTL反应。疫苗对肿瘤的预防作用实验发现,肿瘤出现时?

西洛他唑对小鼠慢性缺血性脑损伤的保护作用及机制

目的:观察西洛他唑对小鼠慢性缺血性脑损伤的保护作用,探讨其与促血管生成的关系。方法:以大脑中动脉栓塞方法诱导小鼠局灶性脑缺血,缺血后1、4、7 h和术后1～14 d腹腔注射西洛他唑(10 mg/kg),每天一次,观察缺血后35 d西洛他唑对神经症状评分、斜板角度、脑梗死体积、神经元密度和缺血侧血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体2(Flk-1)表达的作用。结果:西洛他唑能降低缺血后神经症状评分,提高斜板角度,减少脑梗死体积,增加存活神经元密度和VEGF、Flk-1表达的数目。结论:西洛他唑对小鼠慢性局灶性脑缺血具有保护作用,其作用机制可能与诱导缺血侧VEGF、Flk-1表达,促进血管生成有关。

脊柱转移癌新生血管形成与预后关系

目的 :探讨新生血管形成和脊柱转移癌预后之间的关系。方法 :应用免疫组化技术 ,检测 77例人脊柱转移癌组织血管内皮细胞生长因子 (vascular endothelial cell growth factor,VEGF)、VEGF受体 1(flm s- like tyrosine kinase,FL T)、VEGF受体 2 (kinase insertdomain containing receptor,FL K- 1)表达和微血管密度 (microvessels density,MVD)计数。采用 Spearm an等级相关判断 VEGF、FL K- 1、FL T表达之间及与 MVD计数之间的关系 ,以 COX回归分析判别 VEGF、FL K- 1、FL T表达与预后的关系。 结果 :VEGF、FL T、FL K- 1主要表达于转移癌细胞。新生血管形成多位于转移癌的侵袭性边缘。MVD计数 4 .2～ 5 6 .4 (2 1.6 3± 10 .95 )个。FL K- 1、FL T、VEGF表达和 MVD计数之间均呈显著正相关 (P<0 .0 1)。平均随访时间 15 .6个月(5 .2～ 36个月 ) ,3年生存率为 6 .98%。COX回归分析表明 VEGF、FL K- 1表达及 MVD计数为影响脊柱转移癌患者预后的重要因素 (P<0 .0 5 ,P<0 .0 1) ,其中 VEGF表达上调对患者生存的影响最大。 结论

大鼠局灶脑缺血早期半暗带等值区VEGF及其受体FLT-1、FLL-1mRNA表达水平变化

目的研究大鼠局灶脑缺血早期暗带等值区血管内皮生长因子(VEGF)及其受体FLT-1、FLK-1mRNA表达的动态变化特点。方法建立大鼠大脑中动脉栓塞(MACO)模型,选择MACO后不同时间点(1、3、6、12、24h),采用原位杂交方法测定缺血半暗带等值区VEGF、FLT-1、FLK-1mRNA的表达。结果VEGFmRNA在神经元、胶质细胞中均有表达,FLT-1与FLK-1mRNA主要表达于血管内皮细胞。VEGFmRNA在缺血后3h开始升高,至12h达到高峰,而后下降。FLT-1与FLK-1mRNA在缺血后24h均处于较低水平表达。结论大鼠MACO后24h内,半暗带等值区VEGF与其受体(FLT-1与FLK-1)mRNA表达存在时空不一致现象,FLT-1与FLK-1mRNA的表达调节和作用值得进一步探讨。

兔虹膜色素上皮细胞和视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子及其受体FLK-1 mRNA表达的对比研究

目的 研究血管内皮生长因子 (VEGF)及其受体 (FLK 1)mRNA在健康兔眼虹膜色素上皮 (IPE)细胞和视网膜色素上皮 (RPE)细胞中的表达特征 ,探讨IPE细胞代替RPE细胞用于自体移植治疗年龄相关性黄斑变性 (ARMD)及RPE异常相关疾病的可行性。方法 分离成年健康有色家兔的IPE细胞和RPE细胞 ,采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测其VEGF及其受体FLK 1mRNA的表达情况。结果 兔眼IPE细胞和RPE细胞均可表达VEGF和FLK 1mRNA。IPE细胞的VEGF和FLK 1mRNA含量低于RPE细胞。IPE细胞的VEGFmRNA的表达量约为RPE细胞的 4 4 6 2 % ,FLK 1mRNA的表达量约为RPE细胞的 5 2 36 % ,差异均有显著意义 (P <0 0 0 1)。结论IPE细胞VEGF及其受体FLK 1mRNA的表达水平比RPE细胞低 ,IPE细胞代替RPE进行细胞移植可能更为有利。

氟西汀对抑郁大鼠海马血管新生因子表达的影响

目的探讨氟西汀对抑郁大鼠海马血管新生因子表达的影响。方法SPF级雄性SD大鼠（3月龄）32只，根据随机数字表分为氟西汀组（n=8）、氟西汀＋LY294002干预组（n=8）、模型组（n=8）、对照组（n=8）。对照组不进行任何处理，自由进食及摄水5周。其余各组大鼠均采用慢性温和不可预测的多相应激方法建立抑郁建模。建模后氟西汀组给予氟西汀治疗2周，氟西汀＋LY294002干预组给予LY294002干预后，氟西汀治疗2周，模型组自由进食、饮水2周。实验第5周末所有大鼠（直接将大鼠断头处死，冰浴上取出海马）行免疫印迹实验（Western blot）。结果氟西汀组VEGF（0．98±0．13）、FLK1（1．09±0．21）、AKT1（1．05±0．05）、p-AKT1（1．01±0．13）较模型组VEGF（0．44±0．08）、FLK1（0．37±0．15）、AKT1（0．40±0．10）、p-AKT1（0．53±0．07）的蛋白表达水平明显增加，差异有统计学意义（P〈0．01）。氟西汀组海马VEGF、FLK1、P—AKT1较氟西汀＋LY294002干预组的VEGF（0．55±0．08）、FLK1（0．55±0．14）、p-AKT1（0．60±0．05）蛋白表达明显增加，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论氟西汀可增强抑郁大鼠海马血管新生因子VEGF／FLK1、p-AKT1蛋白的表达，进而参与海马血管的新生，而氟西汀的这种作用可能与P13K／AKT信号通路有关。