Radioprotective effects of the expression of FLT3 ligand regulated by Egr-1 regulated element on radiation injury of SCID mice

Objective: In order to explore the radioprotective effects of the expression of hematopoietic growth factors regulated by radio-inducible promoter on radiation injury. Methods:The human FL (Flt3 ligand) cDNA and EGFP (enhanced green fluorescent protein) cDNA were linked together with IRES and then inserted into the eukaryotic expression vector pCI-Egr, which was constructed by substituting CMV promoter in pCIneo with the Egr-1 promoter (Egr-EF). The vector was transferred into human bone marrow stromal ...

联合使用干细胞因子、FLT3配基与白介素2,7,15体外扩增人脐血来源CIK/NK细胞

通过干细胞因子 (SCF)、FLT3配基 (FL)联合白介素 (IL) 2 ,7,15等的不同组合体系体外扩增人脐血来源的CIK NK细胞 (CB CIK NK) ,探讨不同培养方式对CB CIK NK细胞诱导、扩增产率的影响。按诱导扩增体系的不同分 3组 :A组 (SCF +IL2 +IL7+IL15 ) ,B组 (SCF +FL +IL2 +IL7+IL15 )和C组 (IL2 +IL7+IL15 ,对照组 ) ,培养 2 1天 ,检测CD3+ CD5 6 + CIK细胞、CD3- CD5 6 + NK细胞比例和扩增倍数。结果表明 :经 2 1天培养 ,A ,B及C组CIK细胞比例分别为 (19.84± 2 .93) %、(2 6 .2 0± 4 .0 5 ) %及 (2 4 .0 3± 4 .99) % ;而NK细胞的比例A、B及C组比例分别为 (4 9.6 0± 1.4 0 ) %、(5 1.16± 6 .4 5 ) %及 (30 .85± 8.12 ) %。含SCF +FL的B组扩增效率最高 ,其中CIK细胞的扩增倍数由对照组 (C组 )的 (5 75 81± 2 2 1.72 )倍增加至 (796 .0 9± 2 78.4 7)倍 (最高为 1313倍 ) ;NK细胞由对照组 (C组 )的 (30 .39± 14 .4 7)倍增加至 (6 5 .85± 30 .83)倍 (最高为 12 1.0 6倍 )。结论 :通过合适的细胞因子组合可以同时扩增CB来源的CIK NK细胞 ;联合诱导、扩增CB CIK NK细胞以采用含SCF +FL +IL2 +IL7+IL15的培养体系为佳。

重组人FLT3配体的克隆、表达及功能鉴定

通过克隆人FLT3配体 (rhFL)基因 ,建立其原核高效表达系统 ,为大规模获得rhFL产品 ,促进干细胞体外扩增移植等新技术在临床的应用创造条件。分离人外周血单个核细胞 ,提取总RNA ,采用RT 巢式PCR扩增可溶型FL基因 ,以双脱氧终止法进行DNA序列分析 ;将目的基因与 pProEXHT载体连接 ,重组体引入大肠杆菌并在IPTG诱导下表达 ;亲和层析纯化表达产物 ,观察其刺激CD34 + 细胞增殖的情况。从人外周血单核细胞中克隆得到长 481bp的rhFL基因 ,测序结果与已知人FL基因序列一致 ;rhFL的表达量约占菌体蛋白总量的 15 % ,经亲和纯化纯度达 90 %以上 ;rhFL +G CSF +EPO刺激CD34 + 细胞增殖约 40 0倍。获得了rhFL基因及其在大肠杆菌中的高效表达 ,初步建立了产物纯化途径 ,纯化后的rhFL具有较强的刺激造血干 /祖细胞增殖的能力。

Flt3配体增强HCV核心-包膜E2融合基因DNA疫苗诱导的细胞免疫应答

建立一种可高效诱导细胞免疫应答 ,对丙型肝炎病毒 (HCV)感染可能起预防和治疗作用的DNA疫苗。将小鼠Flt3配体 (FL)信号肽和胞外段cDNA插入结构优化的HCV核心 包膜E2融合抗原DNA疫苗pST CE2t,构建成pST CE2t FL。将pST CE2t FL转染COS7细胞 ,Westernblot和ELISA检测表明该重组质粒能表达HCV核心 包膜E2融合抗原和可溶性小鼠FL。分别将pST CE2t、pST CE2t FL和空载体pCI neo肌肉注射接种BALB c小鼠 ,检测小鼠的体液和细胞免疫应答。结果表明两种DNA结构均能在小鼠体内诱生细胞和体液免疫应答 ,但pST CE2t诱导的体液免疫应答强于pST CE2t FL ,而后者诱导的细胞免疫应答明显强于前者。FL能明显增强HCV核心 包膜E2融合抗原DNA疫苗诱导的细胞免疫应答 ,对于发展HCV预防和治疗性疫苗有潜在的应用价值。

乙型肝炎病毒核心抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和Flt3配体(FL)胞外段的双表达核酸疫苗。方法:将HBcAg和FL胞外段的基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入真核双表达载体pIRES,获得含双基因片段的表达质粒;再取该表达质粒中的内部核糖体切入位点(IRES)序列和基因片段克隆入pJW4303载体中,获得相应的双表达核酸疫苗,经筛选鉴定后,以293T细胞瞬时表达检测两基因的表达水平。结果:构建成功以pIRES、pJW4303为载体的4种HBcAg和FL胞外段的双表达核酸疫苗,体外表达证实HBcAg和FL胞外段均能高效表达,基因位于IRES上游时表达水平较高。结论:用IRES元件实现了HBcAg和FL胞外段双表达核酸疫苗的构建,pJW4303为载体的核酸疫苗两基因表达水平优于pIRES为载体的核酸疫苗。

恶性造血细胞表面Flt3受体的表达及其对Flt3配体的反应性研究

目的 :研究恶性造血细胞表面Flt3受体的表达 ,TNFα和地塞米松 (DXM )对Flt3受体表达的作用及重组人Flt3配体 (rhFL)对恶性造血细胞增殖的影响。方法 :用流式细胞仪测定 18株体外培养的恶性造血细胞株细胞表面Flt3受体 ,用MTT法测定rhFL对恶性造血细胞增殖的影响。结果 :5株细胞表面存在Flt3受体。B淋巴瘤细胞株Raji、Daudi及多发性骨髓瘤细胞株 82 6 6表达高水平Flt3受体 ;髓系白血病细胞株HL 6 0和多发性骨髓瘤细胞株XG 6表达低水平的Flt3受体。用 10 -6mol/LDXM培养 2 4h后 ,上述细胞Flt3受体表达降低 ;用2 0ng/mlTNFα培养 2 4h后 ,Raji和 82 6 6细胞Flt3受体表达降低 ,HL 6 0和XG 6细胞Flt3受体表达增高 ,Daudi细胞Flt3受体表达不受影响。rhFL在 10～ 10 0ng/ml浓度时 ,刺激Raji和HL 6 0细胞的增殖 (P <0 0 5 ) ,但对绝大多数的恶性造血细胞体外无刺激作用。结论 :多数恶性造血细胞不表达Flt3受体 ;rhFL也不引起此类细胞的增殖。地塞米松降低Flt3受体的表达 ,有可能用于防止或降低FL对部分恶性造血细胞的刺激作用 ,使FL的应用更为安全。

Flt3配体修饰小鼠肝癌疫苗的制备及其体内抗肿瘤活性观察

目的 :以小鼠 Flt3配体 (murine flt3ligand,m FL )的重组腺病毒载体 (Adm FL )体外感染小鼠肝癌细胞株 Hepa1- 6制备肝癌疫苗 ,并观察其体内抗肿瘤活性。方法 :腺病毒载体体外感染 Hepa1- 6细胞 ,48h后通过载体所携带的绿色荧光蛋白(GFP)的表达检测感染的效率 ;并用 EL ISA方法检测第 0、2、4、6、8天培养上清中 m FL的表达量 ;每天进行细胞计数 (连续 14d) ,观察细胞的体外生长曲线 ;取 5× 10 6个修饰后的 Hepa1- 6细胞接种 C5 7BL / 6小鼠 ,4周后于原接种部位的对侧再接种 2× 10 6个野生型 Hepa1- 6或 EL 4细胞。结果 :Adm FL能有效感染靶细胞 Hepa1- 6 ,培养上清中 m FL表达量在第 2天最高 ,达到 (71.1± 6 .3) ng/ ml,感染后 Hepa1- 6的体外生长未受到明显抑制 ;修饰后 Hepa1- 6细胞的体内成瘤性下降 ;4周后再接种Hepa1- 6细胞 ,肿瘤生长速度明显降低 ;而再接种的 EL4细胞呈渐进性生长 ,与对照组相比无显著差异。 结论 :腺病毒介导的Flt3配体基因修饰后的肝癌细胞的体内成瘤性下降 ,并能激发特异性免疫保护反应 ,是有效的肝癌疫苗。

阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血患者干细胞因子和FLT3配体及其受体表达的研究

目的:检测干细胞因子(SCF)与FLT3配体(FL)及其受体在阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)与再生障碍性贫血(AA)的表达情况,探讨2者在PNH与AA发病中作用。方法:用ELISA法检测PNH与AA患者骨髓SCF和可溶性FL的含量,用流式细胞术对AA与PNH骨髓单个核细胞c kit与FLT3的表达进行分析。结果:PNH、慢性AA患者SCF含量分别为(456.8±115.2)、(372.6±111.5),与正常对照组(389.2±123.3)比较差异无统计学意义(P>0.05);PNH、慢性AA患者c kit表达分别为(48.8±15.6)、(39.6±11.5),低于正常对照组(75.2±23.3)。PNH患者FL水平为226.3±50.6,明显高于正常对照组(89.4±20.8),但低于慢性AA(658.2±125.5)(P<0.01);PNH、慢性AA患者FLT3表达分别为(13.2±5.8)、(8.5±2.7),与正常对照相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:干细胞因子、FLT3配体及其受体参与PNH与AA的发病,2者共同的发病机制可能为干细胞因子受体缺陷、免疫紊乱。

FLT3配基在人骨髓基质细胞系中的基因转移与表达

目的 :研究逆转录病毒介导的FL在骨髓基质细胞系HFCL中的表达。方法 :采用脂质体法将重组质粒pLF SN/HFCL和空载体 pLXSN/HFCL转染包装细胞PA317,G418筛选抗性克隆 ,用抗性克隆上清液感染HFCL。RT PCR和基因组DNA PCR检测外源基因mRNA水平的表达及染色体的整合 ,小鼠CFU GM集落法检测FL生物学活性。结果 :在mRNA水平有FL的表达 ,染色体基因组中整合有标记neo基因和FL基因。活性测试结果显示转染的骨髓基质细胞分泌FL。结论

重组腺病毒介导的FLT3配体和阿霉素联合治疗小鼠肝癌

目的:将重组腺病毒介导的FLT3配体(FLT3 ligand,FL)与阿霉素(adriamycin,ADM)联合治疗小鼠肝癌,探索基因治疗和化疗相结合治疗肿瘤的新方法。方法:构建携带鼠FL的重组腺病毒载体(AdmFL),单独用其或ADM以及两者联用对实验性肝癌小鼠进行治疗,观察抗肿瘤效果。结果:(1)FL+ADM组小鼠肝癌生长抑制率最大值为56.5％,明显高于ADM组和FL组的27.5％和26.6％(P<0.01);(2)FL+ADM组小鼠早期死亡率为8.3％,明显低于ADM组的37.5％(P<0.01);FL十ADM组小鼠长期生存率为86.4％,明显高于ADM组和FL组的50.0％和41.5％(P<0.01)。结论:(1)FL和ADM治疗小鼠肝癌具有协同作用,FL可显著增强化疗效果;(2)FL能明显降低化疗不良反应。

两个新的人Flt3配体差异剪接体的克隆

目的 :寻找新的人 Flt3配体 (h FL )的差异剪接体。 方法 :从健康志愿者外周血中分离单个核细胞 ,一步法提取总RNA ,逆转录成 c DNA,应用胞外区特异性引物 PCR扩增 h FL的胞外区并克隆至真核表达质粒 ,进行序列测定分析。 结果 :序列分析发现了两个新的 h FL的差异剪接体 ,均发生在重要的第 5外显子功能域 ,分别在 434 bp处有一个胞嘧啶的插入和在42 6～ 478bp之间缺失了 5 3个 bp。 结论 :h FL存在两个新的差异剪接体 ,此项发现为进一步的功能研究提供了基础。

重组人Flt3配体在大肠杆菌中的高效表达和生物学活性的鉴定

根据天然的人Flt3配体(Flt3ligand,FL)基因和遵循适合大肠杆菌BL21(DE3)表达体系表达条件及不改变FL天然蛋白氨基酸序列的原则,对其进行改造,所获得的FL功能片段(FL134)克隆入PET30a表达载体,在C端融合了6个His,继而在大肠杆菌中诱导表达。结果表明重组蛋白rhFL134以包涵体形式在大肠杆菌(BL21)中可得到较高水平的表达。通过蛋白的变性、复性和HiTrapTM亲和层析获得了纯度达92%以上的rhFL134重组蛋白。体外的活性实验显示,重组蛋白rhFL134具有显著的促小鼠骨髓细胞的集落形成和扩增人脐带血中的CD34+细胞的生物学活性。

Flt3-L是否为体外制备急性髓系白血病患者DC瘤苗的更佳选择?

目的:通过对体外使用Flt3-L(FL)及粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导完全缓解期急性髓系白血病(AML-CR)患者的骨髓中单个核细胞(BMNC)分化为树突状细胞(DC)、分泌白介素(IL-12P70),干扰素-α(INF-α)的情况,及所诱导DC体外刺激自体T细胞(auto-T cells)活化增殖能力的观察,进一步了解FL在DC瘤苗制备中的作用特点。方法:分离AML-CR患者BMNC采用FL／GM-CSF单因子培养于RPMI1640完全培养基中至第8天,加入LPS刺激活化后流式细胞仪明确DC免疫表型,ELISA法测定培养液上清中IL-12P70、INF-α,收集阳性细胞体外激发增埴auto-T细胞,MTT法测试T细胞增殖情况。结果:10例AML患者的BMNC经FL／GM-CSF分别培养至第72 h均开始有细胞成簇生长,流式细胞检测显示CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR均表达明显上调,ELISA测定FL组IL-12P70,INF-α分泌量较GM-CSF组有显著增加。2组均可产生较强的T细胞增殖效应,与GM-CSF比,FL组对CD4+T细胞的增殖作用更强。结论:在体外,FL可更强诱导AML-CR患者BMNC产生DC,同时分泌大量IL-12P70及INF-α。故与GM-CSF相比,FL可能具有更佳的抗肿瘤免疫作用。

动态测定急性白血病化疗过程中flt3配体水平变化及意义

目的 :研究急性白血病 (AL )化疗前后骨髓及外周血 FL含量变化及其来源。方法 :夹心酶联免疫吸附法 (Elisa法 )分析了 AL化疗前后骨髓及外周血 flt3配体 (FL )水平变化 ,并应用免疫荧光单标记和双标记流式细胞仪检测技术跟踪确定 FL 的主要产生细胞。结果 :T、B淋巴细胞及单核细胞膜表面仅表达少量膜型 FL;细胞经用皂素穿孔及双标记分析发现 FL 主要贮存在 CD3+细胞内 ;AL 患者化疗前骨髓及外周血 FL 含量略高于正常对照 ,与正常对照无区别 (P >0 .0 5 )。化疗后 FL 水平升高 ,与患者外周血象呈负相关 (r =- 0 .73,P <0 .0 5 ) ,流式细胞分析则提示细胞内 FL 含量减少 ,而细胞膜 FL 表达显著增加。结论 :AL 患者过程中 FL 水平升高与骨髓抑制程度相关 ,FL主要来自 CD3+ 细胞。

Flt3配基与白血病

Flt3配基(FL)是一种与造血调控有关的造血细胞生长因子,其可能与白血病的发病有一定关系,已有体外实验证实,将其作为树突状细胞(DC)的诱导剂,在肿瘤免疫治疗中能开辟一个崭新的领域。该文将FL与白血病方面的关系作一综述。

Flt3配体重组腺病毒感染胃癌细胞的体外研究

目的 研究Flt3配体重组腺病毒(AdmFL)体外感染前小鼠前胃癌细胞的情况。方法 体外分别以不同MOI(mutiplicity of infection)的AdmFL感染胃癌细胞,荧光显微镜下计算感染率,对体外感染后的胃癌细胞连续计数并绘制生长曲线,RT-PCR检测转染后的细胞内mRNA表达,ELISA法检测培养上清中mFl蛋白的浓度。结果 MOI为10、100、500的AdmFL感染小鼠胃癌细胞,荧光显微镜下2 d后根据GFP的表达计算的感染率分别是5％、60％和98％;以MOI为100的AdmFL对体外感染后的胃癌细胞无直接的生长抑制作用;在感染后的胃癌细胞内RT-PCR扩增到了mFL的mRNA,ELISA法检测到mFL蛋白的浓度为60.3±5.2 ng／ml。结论 Flt3配体重组腺病毒能有效地感染小鼠前胃癌细胞,并能介导所携带的mFL高效表达。

人胎肝FLT3配基膜外区基因的克隆及其在COS-7细胞中的表达

FLT3是表达于造血干、祖细胞及胎盘、脑和睾丸等组织的一种Ⅲ型酪氨酸激酶受体。FLT3配基(FL)对造血祖细胞有协同刺激作用。本研究用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法从胎肝组织克隆了FL膜外片段cDNA,其序列与从T淋巴细胞系及胸腺基质细胞系中获得的FL克隆序列完全相同。用真核细胞表达载体pCMV4在COS-7细胞中表达了FL膜外片段。重组人FL(rhFL)可协同GM-CSF增加骨髓细胞中CFU-GM的产率。

FL对辐射所致小鼠多脏器损伤的防护作用

采用 6 .0 Gy60 Coγ射线一次全身照射 BAL B/ C小鼠 ,分别于照前和照后不同时间给予 FL或与其他细胞因子 G- CSF、IL- 11和 EPO联合应用 ,观察其对小鼠外周血细胞计数的影响 ,以及使用这些细胞因子后受照小鼠心、肝、肾、肺、脾、胸腺等脏器的组织病理学改变。结果表明 ,在照前 2 h给予 FL,能加速小鼠外周血细胞尤其是白细胞的恢复 ,并可减轻照射所致小鼠心、肝、肾、肺、脾、胸腺等脏器的损伤。

维肝力对骨髓抑制小鼠骨髓及血清FL分泌水平的影响

目的:研究维肝力对骨髓抑制贫血小鼠骨髓及血清Flt 3配体(FL)分泌水平的影响,探讨维肝力在骨髓造血调控方面的作用。方法:制作骨髓抑制贫血小鼠模型,小鼠随机分为正常组、骨髓抑制贫血模型组、维肝力组(高、中、低剂量100,50,25 g·L^(-1));观察维肝力对骨髓抑制贫血小鼠外周血象、骨髓有核细胞(BMC)数的影响;通过酶联免疫吸附技术(ELISA)检测了骨髓抑制贫血小鼠骨髓及血清Flt3配体(Flt3 ligand,FL)的水平。结果:高剂量维肝力对粒细胞系、红细胞系、血红蛋白(Hb)及BMC均有显著的提高作用,中、低剂量维肝力对血小板促进作用更明显;维肝力组骨髓及血清FL水平均低于贫血组,其中高、中剂量组FL水平下降最为显著。结论:维肝力对放、化疗所引起的小鼠骨髓抑制能起到一定的缓解作用。

质粒载体pIRES2-FL-IL-3转染对脐血CD34^+干细胞增殖影响的实验研究

目的观察真核共表达质粒载体pIRES2-FL-IL-3转染对脐血干细胞增殖水平的影响。方法利用流式细胞检测技术探讨pIRES2-FL-IL-3(共表达组)转染脐血CD34+干细胞后其增殖水平的变化,Western blot技术检测FL和IL-3蛋白表达。另设空白对照组、pIRES2-IL-3组(IL-3组)和pIRES2-FL组(FL组)。结果共表达组细胞增殖指数I、L-3及FL蛋白活性均显著高于对照组I、L-3组和FL组。结论真核共表达质粒载体pIRES2-FL-IL-3转染脐血干细胞后其细胞增殖指数显著提高,与IL-3及FL蛋白活性增加显著相关。