fmrl基因敲除小鼠中间神经元发育研究的新方法

目的:通过杂交技术获得能表达GAD67-GFP的fmrl基因敲除小鼠模型。方法:fmrl基因敲除(fmrl-ko)雌性小鼠(X^-X^-)和GAD67-GFP敲入基因杂合雄性小鼠(2^+2^-)杂交。鼠尾巴提取基因组DNA,用PCR方法鉴定所有子代基因型。对杂交后代小鼠进行行为学观察,并行脑组织切片观察绿色荧光蛋白在γ-氨基丁酸能神经元的表达。结果:PCR方法证实通过杂交繁殖出四种基因型小鼠:同时带有杂合fmrlko及GAD67-GFP位点的雌性小鼠(X^+X^-/2^+2^-)、带有纯合fmrl-ko及GAD67-GFP位点的雄性小鼠(X^-Y/2^+2^-)、不带有GAD67-GFP的雌性和雄性小鼠(X^+X^-/2^-2^-,X^-Y/2^-2^-)。观察发现X^-Y/2^+2^-小鼠具有fmrl-ko小鼠类似的行为学表现,同时在显微镜下观察到X^-Y/2^+2^-小鼠脑组织切片有发绿色荧光的GABA神经元。结论:该杂交小鼠成功表达了GAD67-GFP,为研究γ-氨基丁酸能神经元在脆性X综合征发病机制中的作用提供一种可靠的模型。

不明原因复发性流产女性FMR1基因CGG重复序列多态性研究

目的探讨不明原因复发性流产女性脆性X智力障碍1(FMRl)基因CGG重复序列多态性分布特点。方法收集2018年1月1日至2019年12月31日在石家庄市第四医院复发性流产门诊就诊的具有不明原因复发性流产史的340例患者为研究组;同期在石家庄市第四医院妇科门诊就诊的340例年龄匹配的无流产史女性为对照组。抽取外周血,提取基因组DNA,应用荧光PCR-毛细管电泳法进行FMR1基因CGG重复序列数检测,比较两组的CGG重复序列情况并加以分析。结果两组均无全突变型携带者。研究组中CGG重复序列数最多者为29次(41.5%),其后依次是30次(38.8%)和36次(8.2%);对照组CGG重复序列数最多者为29次(43.2%),其后依次为30次(42.6%)和31次(2.9%)。研究组和对照组FMRl基因CGG重复序列数均数比较无显著性差异[(29.29±5.31)vs.(28.88±5.97)](P>0.05)。研究组FMRl基因中间型携带率显著高于对照组(2.35%vs.0.29%)(P<0.05),CGG重复≥35次的正常等位基因携带率显著高于对照组(10.29%vs.3.53%)(P<0.05)。结论FMRl基因CGG重复序列等位基因中间型以及较大的正常型与不明原因复发性流产可能存在相关性。

Fmr1基因敲除小鼠血清雌性激素含量的比较研究

目的测定不同周龄和超排前后雌性Fmr1基因敲除FVB小鼠和背景FVB小鼠血清生殖激素雌二醇(E2)、孕酮(P)、促黄体生成激素(LH)和促卵泡生成激素(FSH)含量,比较不同周龄和不同状态下敲除基因动物的血清性激素水平,研究敲除基因对动物的发育和生殖生理等方面的影响。方法用放射免疫分析法测定上述动物不同周龄和超排前后血清E2、P、LH和FSH的含量,测定Fmr1基因敲除小鼠不同周龄时的超排卵数,进行统计学分析。结果6周龄的雌性Fmr1基因敲除小鼠与FVB小鼠比较,LH、FSH值差异无显著性(P>0.05),E2的P值差异有显著性(P<0.05)。10周龄的两组动物间血清生殖激素水平和超排卵数均差异无显著性(P>0.05)。10周龄Fmr1基因敲除小鼠的超排卵数与6周龄动物比较差异有显著性(P<0.05)。结论敲除Fmr1基因对动物雌性激素的分泌有影响,该基因与动物的生殖生理有一定的关联。

雌性Fmr1基因敲除小鼠生殖功能的初步研究

目的初步研究敲除Fmr1基因对动物生殖功能的影响。方法6～8周龄雌性Fmr1基因敲除小鼠24只，分为对照组、春季超排组和冬季超排组，每组8只，进行超排，用放射免疫分析法测定超排前后血清雌二醇（E2）、孕酮（P）、促黄体生成素（LH）和促卵泡生成素（FSH）含量，以及不同季节的超排卵数，并进行统计学处理和分析。结果超排后小鼠血清中P和LH含量明显增加[（24．43±13．33）比（1．60±0．46）；（173．86±112．09）比（0．36±0．23）．P〈0．0ll。与冬季（11．44±5．93）比较，春季（37．25±13．91）的超排卵数明显增加（P〈0．01）。结论雌性Fmrl基因敲除小鼠的生殖系统功能没有明显异常。与正常小鼠一样，Frm1基因敲除小鼠机体内P和LH的分泌随动物的生理发育时期而变化。其超排效果随季节而有显著不同。

采用PCR方法检测Fmr1基因敲除小鼠的基因型

目的为Fmr1基因敲除小鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法设计两对引物扩增野生型Fmr1基因和Fmr1缺陷突变基因的DNA片段,用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度,并将所得基因型结果与经典的western blot方法比较。结果野生型仅在800bp处有一条条带,突变纯合子仅在500bp处有一条条带,杂合子则在500bp和800bp处出现两条条带。用PCR方法获得的Fmr1基因分析结果与经典的western blot方法获得的结果完全一致。结论用PCR方法分析Fmr1基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。

人脑对牙髓冷刺激痛反应的功能性磁共振成像研究

目的:探讨牙髓冷刺激痛时的大脑皮层兴奋位点。方法:选取右上颌第一前磨牙冷刺激痛患者(P-R)及正常对照(N-R)各8名,采集右上颌第一前磨牙冷水刺激时全脑血氧水平依赖反应(BOLD)对比的fMRI扫描数据,利用SPM2软件包进行数据分析并产生脑功能图像。结果:P-R组右侧激活最强的岛叶/SII在左侧激活较低,右侧基底节、扣带回、中脑红核的强度都略高于左侧,BA7、丘脑为右侧单侧激活。而左侧激活最强的Broca运动语言区BA44、MII/PMC/BA4,6在右侧没有激活。N-R组激活较强的有SI/MI、MII/PMC、基底节、BA7、BA40。结论:牙痛时前运动皮质、辅助运动皮质和Broca运动语言区的激活较强,在多数皮层为双侧激活,与躯体痛相比某些脑区在同侧大脑半球的激活比对侧更强。

外关穴配伍支沟穴皮部浅刺和常规针刺激活脑区的fMRI比较研究

运用fMRI探讨外关穴配伍支沟穴皮部浅刺激和常规深度刺激激活脑功能区的特点。方法:8名健康志愿者先后进行外关穴配伍支沟穴皮部浅刺激和常规深度刺激,运用GE公司1.5T超导核磁共振系统完成脑部fMRI扫描,基于感兴趣区(ROI)观察局部脑区的功能变化,用统计学方法比较激活几率、激活点数和激活强度。结果:两种方法对左右不同脑区都有不同程度的激活,统计表明无显著性差异(P>0.05);但有趋势表明,皮部浅刺相对集中激活额叶,常规针刺相对集中激活枕叶、小脑和基底节区。结论:外关穴配伍支沟穴皮部浅刺激和常规深度刺激对脑功能区的激活没有显著差异,但二者有着作用倾向的不同。表明两种层次的针刺刺激产生的效应,与脑部整合作用相关。

Fmr1基因敲除小鼠脏器重量和脏器系数的比较分析

目的通过对Fmr1基因敲除小鼠雌雄两性和FVB小鼠的脏器重量和脏器系数进行比较分析,了解其脏器重量的差异,探讨Fmr1基因对动物生长发育等方面的影响。方法分别测定Fmr1基因敲除小鼠雌雄两性和FVB小鼠内脏器官的绝对重量和脏器系数,并进行统计学处理和分析。结果相同年龄的Fmr1基因敲除小鼠雄性的体重、心、肺、肝和肾的绝对重量均极显著的大于雌性(P<0.01)。雌雄间脏器系数除肾脏(P<0.05)和脑(P<0.01)外,其余无显著差异。与FVB小鼠比较,Fmr1基因敲除小鼠心脏较轻(P<0.01),肾脏(P<0.01)、体重和脑较重(P<0.05)。脏器系数肾脏较大(P<0.01),心脏(P<0.01)、脑和脾(P<0.05)较小。结论Fmr1基因可影响动物的某些脏器重量和脏器系数。

脑fMRI特征重建的分层快速聚类方法

在对大脑fMRI感兴趣区域的分析中,利用特征选择所得到的筛选属性进行特征重建问题上,提出了分层快速聚类的分析方法,同已有K-均值聚类方法相比,在聚类有效性得到提高的前提下,总体降低了聚类的时间代价,并为后续的回归分析处理提供了精确保证。

GSK3抑制剂氯化锂对脆性X综合征模型小鼠避暗行为的干预作用

目的探讨糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase3,GSK3)抑制剂氯化锂对脆性X综合症小鼠模型的避暗行为的干预作用及机制。方法通过对30日龄脆性X综合症小鼠连续腹腔注射不同剂量氯化锂5 d,用药第4天和第5天进行避暗实验;同时用免疫印迹技术检测Fmr1 knockout(KO)及wild type(WT)小鼠的海马和皮层总GSK 3β和磷酸化GSK 3β(P-GSK3β)的变化。结果在避暗实验中,KO鼠与WT鼠,两者潜伏期及错误次数分别为(56±32)s,(83±24)s;(7±3)次,(3±2)次;免疫印迹实验结果:KO鼠皮层及海马P-GSK3β表达平均灰度值分别为69,63;WT鼠皮层和海马均为100。注射氯化锂后,KO鼠和WT鼠总GSK3β无明显改变,而KO鼠60 mg/kg,120 mg/kg,200 mg/kg组皮层P-GSK3β表达平均灰度值分别为:147,151,234;海马P-GSK3β分别为108,111,146,较空白组增多;P<0.05。WT鼠用氯化锂后,潜伏期和错误次数以及P-GSK3β表达变化无统计学意义。结论氯化锂能改善KO鼠的学习记忆能力,可能与氯化锂导致的P-GSK3β的表达增加有关,对脆性X综合征基因敲除小鼠有治疗作用。

联合改进SVR和渐消记忆递推最小二乘算法的电能表误差评估模型研究

针对电能计量装置运行误差现场检定难度大、定期轮换成本高等问题,提出一种联合麻雀搜索算法(SSA)、支持向量回归机(SVR)和渐消记忆递推最小二乘算法(FMRLS)的电能表误差评估模型。该方法首先利用改进的K-Means算法对台区进行分类,将分类后的样本导入利用SSA优化后的SVR模型进行训练,建立台区线损率预测模型;而后将得到的线损率代入改进的线损模型,构建电能表误差求解方程,利用FMRLS算法对误差方程进行求解,对电能表误差进行估计。通过河北省某低压台区样本的数据验证,该方法可以实现对低压台区线损率的有效预测,并估计出在运电能表的误差,为加快推进智能电能表检修策略由定期更换转向状态轮换提供技术保障。

GSK3抑制剂氯化锂对Fmr1基因敲除小鼠痛觉敏感性的影响

目的:探讨氯化锂对Fmr1基因敲除小鼠(KO鼠)痛觉敏感性的影响及机制。方法:8周龄KO鼠及野生型(WT鼠)小鼠第1天测定热刺激缩足反射潜伏期(paw withdraw thermal latency,PWTL)值作为基础痛阈,第2～5天腹腔注射氯化锂后测定PWTL值,第6天给药后取脊髓腰骶膨大段组织,通过免疫组化及Western blot检测实验小鼠脊髓GSK3β和P-GSK3β水平的变化。结果:KO鼠的PWTL值比WT鼠明显升高。使用氯化锂后,KO鼠PWTL值恢复至WT鼠水平。KO鼠脊髓P-GSK3β表达较WT鼠明显减少。使用氯化锂后,KO鼠脊髓P-GSK3β表达增多。结论:KO鼠热痛觉敏感性降低。KO鼠脊髓P-GSK3β表达减少可能是KO鼠热痛觉敏感性降低的原因之一;氯化锂可能通过增加脊髓中P-GSK3β的表达而改善KO鼠热痛觉敏感性。

Fmr1基因敲除小鼠大脑的磁共振波谱研究

目的探讨氢质子磁共振波谱成像(~1H-MRS)测定Fmr1基因敲除小鼠(KO小鼠)脑内代谢物的变化及诊断价值。方法 23只4月龄KO小鼠(实验组)和16只野生型FVB小鼠(WT小鼠,对照组)采用3.0T高场强MRI行~1H-MRS,测量小鼠大脑皮质与海马区N-乙酰天门冬氨酸(NAA)、胆碱(Cho)和肌酐(Cr)的峰下面积,计算NAA/Cr和Cho/Cr比值并进行两样本均数t检验。结果与对照组比较,实验组小鼠NAA/Cr比值明显降低(t=-5.912,P<0.01),Cho/Cr比值明显升高(t=3.888,P<0.01)。结论~1H-MRS能定量测定KO小鼠脑内代谢物(细胞膜代谢)异常,可能为诊断及评价脆性X综合征疗效提供重要依据。

Fmr1基因敲除小鼠的被动回避行为及海马GAD的表达变化

目的探讨Fmr1基因敲除小鼠的学习记忆功能和海马的谷氨酸脱羧酶(GAD)表达变化的关系。方法对4周龄和6周龄的基因敲除型(KO)鼠和野生型(WT)鼠分别连续进行2天的被动回避行为的避暗和跳台实验观察后使用免疫印迹技术检测海马GAD的表达变化,根据所获得的数据进行多因素方差分析处理。结果避暗实验中,4周龄和6周龄KO鼠潜伏期比WT鼠明显少(P<0.05);而KO鼠的错误次数比WT鼠明显多(P<0.05);4周龄和6周龄KO鼠或WT鼠的潜伏期、错误次数无差异(P>0.05),同周龄WT鼠第一天的潜伏期和错误与第二天相比无差异(P<0.05)。跳台实验中,4周龄和6周龄KO鼠的潜伏期比WT鼠明显少(P<0.05);而KO鼠的错误次数比WT鼠明显多(P<0.05);4周龄和6周龄KO鼠或WT鼠的潜伏期、错误次数无差异(P>0.05);同周龄第一天KO鼠的潜伏期和错误次数与第二天相比无差异(P>0.05);同周龄第一天WT鼠的潜伏期和错误次数与第二天相比有显著差异(P<0.05)。GAD65/67蛋白在KO鼠海马表达比WT鼠增多(P<0.05);随着周龄的增加,6周龄KO鼠或WT鼠的GAD65/67蛋白表达比4周龄表达增多(P<0.05)。结论 4周龄和6周龄Fmr1基因敲除小鼠存在认知功能障碍,海马的GAD的表达异常变化可能介导Fmr1基因敲除小鼠学习记忆障碍。

GSK3抑制剂氯化锂对Fmr1基因敲除小鼠的痛觉敏感性的影响

目的探讨氯化锂对Fmr1基因敲除小鼠(KO鼠)的痛觉敏感性的影响及机制。方法 8周龄KO小鼠第1天测定热刺激缩足反射潜伏期(PWTL)值,作为基础痛阈,第2、3、4、5天连续腹腔注射氯化锂,给药30 min后测定PWTL值,第6天给药30 min后取腰骶膨大段脊髓组织,通过免疫印迹技术检测KO及WT鼠脊髓水平的GSK3β和P-GSK3β的变化。结果8周龄KO鼠的痛阈均比同周龄WT鼠的痛阈高。使用氯化锂后,KO鼠痛阈下降,且与WT鼠相比差异无统计学意义。8周龄KO鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的P-GSK3β的表达较WT鼠明显减少。使用氯化锂后,KO鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的P-GSK3β的表达增多,而WT鼠的变化不明显。8周龄KO鼠及WT鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的GSK3β的表达在用药前后均无明显改变。结论 KO鼠热痛觉阈值增高,热痛觉敏感性降低。KO鼠腰骶膨大段脊髓后角的P-GSK3β表达减少可能是KO鼠热痛觉敏感性降低的原因之一;氯化锂可能通过增加脊髓后角中的P-GSK3β的表达而改善KO的鼠热痛觉敏感性。

Fmr1基因敲除对小鼠生长发育的影响

目的：Fmr1基因敲除对小鼠生长发育的影响.方法：挑选10周龄FVB小鼠和Fmr1基因敲除小鼠各20只（雌、雄各半）,采取1∶1同居,全同胞兄妹近交繁殖,测定子代生长发育指标,进行统计分析.结果：Fmr1基因敲除小鼠体质量与体长分别为：0 d,（1.25.4±0.21）g,（38.99±1.74）mm;21 d,（8.17±2.26）g,（122.81±11.42）mm;60 d,（22.93±2.93）g,（180.19±7.46）mm;FVB小鼠体质量与体长分别为：0 d,（1.33±0.23）g,（40.53±3.05）mm;21 d,（7.75±1.56）g,（118.73±7.85）mm;60 d,（21.11±1.99）g,（176.43±5.73）mm.两个品系的小鼠体质量与体长的增长差异无统计学意义（P〉0.05）.结论：Fmr1基因敲除不影响小鼠正常的生长发育.

α-细辛醚对Fmr1基因敲除小鼠跳台行为和海马P-Akt表达的影响

目的通过观察α-细辛醚对Fmr1基因敲除小鼠(KO鼠)跳台行为和海马磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)表达的影响,初步探讨α-细辛醚对KO鼠学习记忆缺陷的治疗作用及其可能的机制。方法采用4周龄纯合子(-/-)FVB Fmr1基因敲除型及4周龄纯合子(+/+)FVB野生型(WT)近交系小鼠小鼠共计231只。KO及WT小鼠各分7组,分别为:空白对照组,阴性对照组(生理盐水组),α-细辛醚治疗组3 mg/kg组,6 mg/kg组,9 mg/kg组,12 mg/kg组,24 mg/kg组,KO小鼠每组16只;WT小鼠每组17只。4周龄小鼠予连续腹腔注射生理盐水及α-细辛醚6 d,第7天腹腔注射30 min后行跳台实验(第1天),测定小鼠避暗及跳台潜伏期和错误次数,第8天腹腔注射30 min后行跳台实验(第2天),测定小鼠避暗及跳台潜伏期和错误次数,第9天腹腔注射30 min后取脑海马,并通过Western blot观察小鼠海马内P-Akt及Akt表达。结果跳台实验结果:KO小鼠阴性对照组,3 mg/kg,6 mg/kg,9 mg/kg及12 mg/kg用药组的跳台潜伏期较空白对照组有明显增高(P<0.05),而在24 mg/kg组,虽然潜伏期较空白组有增加,但是无统计学意义差异(P>0.05)。KO小鼠各组的跳台实验错误次数之间无统计学差异(P>0.05)。WT小鼠腹腔注射生理盐水及不同剂量α-细辛醚后,各组间的跳台实验的潜伏期及错误次数均无统计学差异(P>0.05)。KO小鼠海马中的P-Akt均较WT小鼠明显减少。而Akt的表达在KO及WT小鼠中均无统计学意义的变化(P>0.05)。用药后KO小鼠各用药组之间P-Akt表达变化无统计学差异(P>0.05)。结论部分α-细辛醚剂量可改善KO小鼠的跳台行为,KO小鼠的Akt通路可能受损,这可能是导致KO小鼠学习记忆受损的可能原因之一。

Fmr1基因敲除小鼠的三箱社交新奇偏好行为观察

目的对6周龄的Fmr1基因敲除小鼠的三箱社交行为进行针对性的观察,分析其是否有社交新奇偏好。方法通过采用SMART软件对Fmr1基因敲除小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的三箱社交行为进行针对性的观察,对所得到的相关数据进行独立样本t检验的分析。结果运用SMART软件分析,发现在三箱第二阶段的实验中,WT组、KO组小鼠与陌生小鼠分别接触的时间为(197.5±91.4)s和(4.4±4.9)s,WT组、KO组小鼠与陌生小鼠分别接触的次数为(26.4±13.1)次和(2.6±2.7)次,两组数据差异有统计学意义(P<0.05)。结论在三箱社交实验中,与野生型小鼠相比,Fmr1基因敲除小鼠没有社交新奇偏好。

Fmr1小鼠的跳台实验和海马哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的关系

目的观察Fmr1基因敲除(KO)小鼠跳台实验行为及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的变化,探讨mTOR与KO小鼠学习记忆能力的关系。方法利用PCR技术鉴定20只4周龄FVB近交系KO及20只野生型(WT)小鼠,随机分为行为学前WT组、行为学后WT组、行为学前KO组和行为学后KO组。通过避暗实验测试行为学WT及KO组小鼠的学习记忆能力,Western blot检测各组海马区p-mTOR及mTOR表达的变化。结果跳台实验第1天KO鼠的潜伏期较WT鼠短,错误次数较WT鼠多。跳台实验第2天KO鼠的潜伏期较WT鼠短,错误次数较WT鼠多。Western blot检测显示:KO鼠空白组mTOR表达较WT鼠空白组增高(P<0.05);KO鼠空白组PmTOR与WT鼠空白组相比表达增高(P<0.05)。结论 Fmrp对mTOR信号通路具有负性调节作用;Fmr1基因敲除小鼠学习记忆能力障碍与mTOR信号通路受损有关。

Fmr1基因敲除小鼠生后不同发育阶段的附睾iNOS的变化

目的对不同周龄的Fmr1基因敲除和野生型雄性小鼠附睾组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达进行分析比较,探讨Fmr1基因敲除小鼠的附睾组织iNOS表达的差异,为脆性综合征的研究提供背景资料。方法本研究采用不同周龄(4、6、8、10周)的Fmr1(fragile X mental retardation 1)基因敲除型(knockout,KO)和野生型(wild-type,WT)各6只,先采用聚合酶链式反应(PCR)技术对KO小鼠和WT小鼠进行基因型鉴定,之后所有小鼠麻醉取附睾组织、石蜡包埋切片进行免疫组织化学染色技术对KO小鼠和WT小鼠附睾iNOS的表达进行检测并作对比分析。结果 iNOS在4周小鼠附睾阳性表达,在6、8和10周小鼠呈强阳性表达,且KO小鼠附睾的阳性表达均弱于WT小鼠。结论 Fmr1基因敲除小鼠在缺失Fmr1蛋白(fragile X retardation-1 protein,FMRP)后的附睾iNOS的表达降低。