采用PCR方法检测Fmr1基因敲除小鼠的基因型

目的为Fmr1基因敲除小鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法设计两对引物扩增野生型Fmr1基因和Fmr1缺陷突变基因的DNA片段,用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度,并将所得基因型结果与经典的western blot方法比较。结果野生型仅在800bp处有一条条带,突变纯合子仅在500bp处有一条条带,杂合子则在500bp和800bp处出现两条条带。用PCR方法获得的Fmr1基因分析结果与经典的western blot方法获得的结果完全一致。结论用PCR方法分析Fmr1基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。

Fmr1基因敲除小鼠脏器重量和脏器系数的比较分析

目的通过对Fmr1基因敲除小鼠雌雄两性和FVB小鼠的脏器重量和脏器系数进行比较分析,了解其脏器重量的差异,探讨Fmr1基因对动物生长发育等方面的影响。方法分别测定Fmr1基因敲除小鼠雌雄两性和FVB小鼠内脏器官的绝对重量和脏器系数,并进行统计学处理和分析。结果相同年龄的Fmr1基因敲除小鼠雄性的体重、心、肺、肝和肾的绝对重量均极显著的大于雌性(P<0.01)。雌雄间脏器系数除肾脏(P<0.05)和脑(P<0.01)外,其余无显著差异。与FVB小鼠比较,Fmr1基因敲除小鼠心脏较轻(P<0.01),肾脏(P<0.01)、体重和脑较重(P<0.05)。脏器系数肾脏较大(P<0.01),心脏(P<0.01)、脑和脾(P<0.05)较小。结论Fmr1基因可影响动物的某些脏器重量和脏器系数。

GSK3抑制剂氯化锂对脆性X综合征模型小鼠避暗行为的干预作用

目的探讨糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase3,GSK3)抑制剂氯化锂对脆性X综合症小鼠模型的避暗行为的干预作用及机制。方法通过对30日龄脆性X综合症小鼠连续腹腔注射不同剂量氯化锂5 d,用药第4天和第5天进行避暗实验;同时用免疫印迹技术检测Fmr1 knockout(KO)及wild type(WT)小鼠的海马和皮层总GSK 3β和磷酸化GSK 3β(P-GSK3β)的变化。结果在避暗实验中,KO鼠与WT鼠,两者潜伏期及错误次数分别为(56±32)s,(83±24)s;(7±3)次,(3±2)次;免疫印迹实验结果:KO鼠皮层及海马P-GSK3β表达平均灰度值分别为69,63;WT鼠皮层和海马均为100。注射氯化锂后,KO鼠和WT鼠总GSK3β无明显改变,而KO鼠60 mg/kg,120 mg/kg,200 mg/kg组皮层P-GSK3β表达平均灰度值分别为:147,151,234;海马P-GSK3β分别为108,111,146,较空白组增多;P<0.05。WT鼠用氯化锂后,潜伏期和错误次数以及P-GSK3β表达变化无统计学意义。结论氯化锂能改善KO鼠的学习记忆能力,可能与氯化锂导致的P-GSK3β的表达增加有关,对脆性X综合征基因敲除小鼠有治疗作用。

GSK3抑制剂氯化锂对Fmr1基因敲除小鼠痛觉敏感性的影响

目的:探讨氯化锂对Fmr1基因敲除小鼠(KO鼠)痛觉敏感性的影响及机制。方法:8周龄KO鼠及野生型(WT鼠)小鼠第1天测定热刺激缩足反射潜伏期(paw withdraw thermal latency,PWTL)值作为基础痛阈,第2～5天腹腔注射氯化锂后测定PWTL值,第6天给药后取脊髓腰骶膨大段组织,通过免疫组化及Western blot检测实验小鼠脊髓GSK3β和P-GSK3β水平的变化。结果:KO鼠的PWTL值比WT鼠明显升高。使用氯化锂后,KO鼠PWTL值恢复至WT鼠水平。KO鼠脊髓P-GSK3β表达较WT鼠明显减少。使用氯化锂后,KO鼠脊髓P-GSK3β表达增多。结论:KO鼠热痛觉敏感性降低。KO鼠脊髓P-GSK3β表达减少可能是KO鼠热痛觉敏感性降低的原因之一;氯化锂可能通过增加脊髓中P-GSK3β的表达而改善KO鼠热痛觉敏感性。

Fmr1基因敲除小鼠大脑的磁共振波谱研究

目的探讨氢质子磁共振波谱成像(~1H-MRS)测定Fmr1基因敲除小鼠(KO小鼠)脑内代谢物的变化及诊断价值。方法 23只4月龄KO小鼠(实验组)和16只野生型FVB小鼠(WT小鼠,对照组)采用3.0T高场强MRI行~1H-MRS,测量小鼠大脑皮质与海马区N-乙酰天门冬氨酸(NAA)、胆碱(Cho)和肌酐(Cr)的峰下面积,计算NAA/Cr和Cho/Cr比值并进行两样本均数t检验。结果与对照组比较,实验组小鼠NAA/Cr比值明显降低(t=-5.912,P<0.01),Cho/Cr比值明显升高(t=3.888,P<0.01)。结论~1H-MRS能定量测定KO小鼠脑内代谢物(细胞膜代谢)异常,可能为诊断及评价脆性X综合征疗效提供重要依据。

GSK3抑制剂氯化锂对Fmr1基因敲除小鼠的痛觉敏感性的影响

目的探讨氯化锂对Fmr1基因敲除小鼠(KO鼠)的痛觉敏感性的影响及机制。方法 8周龄KO小鼠第1天测定热刺激缩足反射潜伏期(PWTL)值,作为基础痛阈,第2、3、4、5天连续腹腔注射氯化锂,给药30 min后测定PWTL值,第6天给药30 min后取腰骶膨大段脊髓组织,通过免疫印迹技术检测KO及WT鼠脊髓水平的GSK3β和P-GSK3β的变化。结果8周龄KO鼠的痛阈均比同周龄WT鼠的痛阈高。使用氯化锂后,KO鼠痛阈下降,且与WT鼠相比差异无统计学意义。8周龄KO鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的P-GSK3β的表达较WT鼠明显减少。使用氯化锂后,KO鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的P-GSK3β的表达增多,而WT鼠的变化不明显。8周龄KO鼠及WT鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的GSK3β的表达在用药前后均无明显改变。结论 KO鼠热痛觉阈值增高,热痛觉敏感性降低。KO鼠腰骶膨大段脊髓后角的P-GSK3β表达减少可能是KO鼠热痛觉敏感性降低的原因之一;氯化锂可能通过增加脊髓后角中的P-GSK3β的表达而改善KO的鼠热痛觉敏感性。

Fmr1基因敲除小鼠的被动回避行为及海马GAD的表达变化

目的探讨Fmr1基因敲除小鼠的学习记忆功能和海马的谷氨酸脱羧酶(GAD)表达变化的关系。方法对4周龄和6周龄的基因敲除型(KO)鼠和野生型(WT)鼠分别连续进行2天的被动回避行为的避暗和跳台实验观察后使用免疫印迹技术检测海马GAD的表达变化,根据所获得的数据进行多因素方差分析处理。结果避暗实验中,4周龄和6周龄KO鼠潜伏期比WT鼠明显少(P<0.05);而KO鼠的错误次数比WT鼠明显多(P<0.05);4周龄和6周龄KO鼠或WT鼠的潜伏期、错误次数无差异(P>0.05),同周龄WT鼠第一天的潜伏期和错误与第二天相比无差异(P<0.05)。跳台实验中,4周龄和6周龄KO鼠的潜伏期比WT鼠明显少(P<0.05);而KO鼠的错误次数比WT鼠明显多(P<0.05);4周龄和6周龄KO鼠或WT鼠的潜伏期、错误次数无差异(P>0.05);同周龄第一天KO鼠的潜伏期和错误次数与第二天相比无差异(P>0.05);同周龄第一天WT鼠的潜伏期和错误次数与第二天相比有显著差异(P<0.05)。GAD65/67蛋白在KO鼠海马表达比WT鼠增多(P<0.05);随着周龄的增加,6周龄KO鼠或WT鼠的GAD65/67蛋白表达比4周龄表达增多(P<0.05)。结论 4周龄和6周龄Fmr1基因敲除小鼠存在认知功能障碍,海马的GAD的表达异常变化可能介导Fmr1基因敲除小鼠学习记忆障碍。

Fmr1基因敲除对小鼠生长发育的影响

目的：Fmr1基因敲除对小鼠生长发育的影响.方法：挑选10周龄FVB小鼠和Fmr1基因敲除小鼠各20只（雌、雄各半）,采取1∶1同居,全同胞兄妹近交繁殖,测定子代生长发育指标,进行统计分析.结果：Fmr1基因敲除小鼠体质量与体长分别为：0 d,（1.25.4±0.21）g,（38.99±1.74）mm;21 d,（8.17±2.26）g,（122.81±11.42）mm;60 d,（22.93±2.93）g,（180.19±7.46）mm;FVB小鼠体质量与体长分别为：0 d,（1.33±0.23）g,（40.53±3.05）mm;21 d,（7.75±1.56）g,（118.73±7.85）mm;60 d,（21.11±1.99）g,（176.43±5.73）mm.两个品系的小鼠体质量与体长的增长差异无统计学意义（P〉0.05）.结论：Fmr1基因敲除不影响小鼠正常的生长发育.

α-细辛醚对Fmr1基因敲除小鼠跳台行为和海马P-Akt表达的影响

目的通过观察α-细辛醚对Fmr1基因敲除小鼠(KO鼠)跳台行为和海马磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)表达的影响,初步探讨α-细辛醚对KO鼠学习记忆缺陷的治疗作用及其可能的机制。方法采用4周龄纯合子(-/-)FVB Fmr1基因敲除型及4周龄纯合子(+/+)FVB野生型(WT)近交系小鼠小鼠共计231只。KO及WT小鼠各分7组,分别为:空白对照组,阴性对照组(生理盐水组),α-细辛醚治疗组3 mg/kg组,6 mg/kg组,9 mg/kg组,12 mg/kg组,24 mg/kg组,KO小鼠每组16只;WT小鼠每组17只。4周龄小鼠予连续腹腔注射生理盐水及α-细辛醚6 d,第7天腹腔注射30 min后行跳台实验(第1天),测定小鼠避暗及跳台潜伏期和错误次数,第8天腹腔注射30 min后行跳台实验(第2天),测定小鼠避暗及跳台潜伏期和错误次数,第9天腹腔注射30 min后取脑海马,并通过Western blot观察小鼠海马内P-Akt及Akt表达。结果跳台实验结果:KO小鼠阴性对照组,3 mg/kg,6 mg/kg,9 mg/kg及12 mg/kg用药组的跳台潜伏期较空白对照组有明显增高(P<0.05),而在24 mg/kg组,虽然潜伏期较空白组有增加,但是无统计学意义差异(P>0.05)。KO小鼠各组的跳台实验错误次数之间无统计学差异(P>0.05)。WT小鼠腹腔注射生理盐水及不同剂量α-细辛醚后,各组间的跳台实验的潜伏期及错误次数均无统计学差异(P>0.05)。KO小鼠海马中的P-Akt均较WT小鼠明显减少。而Akt的表达在KO及WT小鼠中均无统计学意义的变化(P>0.05)。用药后KO小鼠各用药组之间P-Akt表达变化无统计学差异(P>0.05)。结论部分α-细辛醚剂量可改善KO小鼠的跳台行为,KO小鼠的Akt通路可能受损,这可能是导致KO小鼠学习记忆受损的可能原因之一。

Fmr1基因敲除小鼠的三箱社交新奇偏好行为观察

目的对6周龄的Fmr1基因敲除小鼠的三箱社交行为进行针对性的观察,分析其是否有社交新奇偏好。方法通过采用SMART软件对Fmr1基因敲除小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的三箱社交行为进行针对性的观察,对所得到的相关数据进行独立样本t检验的分析。结果运用SMART软件分析,发现在三箱第二阶段的实验中,WT组、KO组小鼠与陌生小鼠分别接触的时间为(197.5±91.4)s和(4.4±4.9)s,WT组、KO组小鼠与陌生小鼠分别接触的次数为(26.4±13.1)次和(2.6±2.7)次,两组数据差异有统计学意义(P<0.05)。结论在三箱社交实验中,与野生型小鼠相比,Fmr1基因敲除小鼠没有社交新奇偏好。

α-细辛醚对Fmr1基因敲除小鼠的自主活动的干预作用

目的探讨α-细辛醚对Fmr1基因敲除小鼠的自主活动的干预作用。方法选取30日龄Fmr1基因敲除小鼠(KO小鼠)和FVB野生型小鼠(WT小鼠)为研究对象,将KO和WT两种类型的小鼠分别分为7小组,每组15只。其中1组作为对照组给予生理盐水,另外6小组连续腹腔注射不同剂量α-细辛醚(3 mg/kg、6 mg/kg、9 mg/kg、12 mg/kg、24 mg/kg、36mg/kg)5天,用药第5天进行自主活动行为学实验,观察α-细辛醚能否改善KO鼠的过度活动的表型。结果在行为学自主活动实验中,KO鼠的活动次数比WT鼠的活动次数多,站立次数比WT鼠的站立次数少,差异具有统计学意义(P<0.05);使用α-细辛醚后,KO鼠的活动次数明显减少,站立次数明显增多,差异均具有统计学意义(P均<0.05)。结论α-细辛醚能改善KO鼠的的活动过度的表型,可能对Fmr1基因敲除小鼠有治疗作用。

Fmr1基因敲除小鼠耳蜗的GABAα1受体的表达

目的对4周龄Fmr1基因敲除小鼠耳蜗的GABAα1受体表达进行观察,探讨耳蜗GABAα1受体的表达是否受FMRP的影响。方法使用PCR技术对Fmr1基因敲除小鼠鉴定后,对4周龄的Fmr1基因敲除小鼠和野生型小鼠进行耳蜗的GABAα1受体免疫组织化学的表达观察,数据采用多因素方差分析处理。结果耳蜗HE染色结果:4周龄组KO鼠较WT鼠形态学观察无差异。4周龄KO小鼠的耳蜗中GABAα1受体表达的平均阳性细胞数均低于WT小鼠,P<0.01,差异具有统计学意义。结论 GABAα1受体表达的降低可能与FMR1基因KO小鼠听源性惊厥发病有关。