牛乳源金黄色葡萄球菌黏附素分子FnBPA不同功能区生物学活性的比较分析

旨在研究和比较牛乳源金黄色葡萄球菌黏附素分子A区(FnBPA-A)和BCD区(FnBPA-BCD)两个功能区重组蛋白质免疫后的生物学功能,并评价其作为抗原开展研制抗金黄色葡萄球菌疫苗的价值。利用原核表达载体pET-28a分别表达重组蛋白质FnBPA-A与FnBPA-BCD,比较二者的黏附特性,并用纯化后的重组蛋白质单独及联合免疫方式免疫新西兰白兔和小鼠,分析比较各组蛋白质诱导的特异性抗体抑制菌体及对纤维蛋白原(Fg)、纤维连接素(Fn)的结合能力,免疫小鼠抗体水平及对小鼠的免疫保护力。结果表明,两种重组蛋白质具有不同的黏附活性,联合免疫组产生的特异性抗体水平及与Fg、Fn的结合能力均较单独免疫组高。重组蛋白质FnBPA的A区及两种蛋白质联合免疫组特异性抗体水平,抗血清对金黄色葡萄球菌Fg,Fn黏附的抑制能力要优于BCD区。免疫小鼠攻毒结果显示各免疫组均对小鼠有良好的保护效果,其中FnBPA的A区蛋白质免疫保护率高于其他试验组。该研究的结果可为牛源金黄色葡萄球菌性的乳腺炎新型疫苗的优化设计与合理应用提供依据。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组亚单位疫苗FnBPA的免疫保护作用研究

目的评价耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)候选疫苗抗原FnBPA活性片段的免疫原性以及其在抵抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染中的免疫保护作用。方法构建pGEX-6p-2-FnBPA表达载体,经可溶表达及亲和纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠。末次免疫后的第7天,分离免疫小鼠的血清ELISA检测IgG及其亚型抗体水平,同时测定体外抗体介导的调理吞噬作用。末次免疫后的第14天,经尾静脉感染ATCC国际标准株MRSA-252,统计分析感染后各组的小鼠的生存率以及检测脾脏,肾脏的细菌定植量。结果成功构建、表达及纯化了FnBPA活性片段,重组蛋白纯度可达90%;免疫后诱导小鼠机体产生了高效价的IgG抗体,并在体外能发挥抗体介导的调理吞噬作用;在感染保护评价实验中,与对照组相比,实验组的生存率显著提高(P<0.01),并显著降低了脾脏与肾脏的细菌定植量(P<0.05)。结论耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组亚单位疫苗FnBPA具有良好的免疫原性和免疫保护作用,可以作为MRSA疫苗研究的重要候选抗原。

重组金黄色葡萄球菌FnbpA亚单位疫苗的研制

【目的】制备金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A(FnbpA)基因工程亚单位疫苗,并以小白鼠为试验模型,检测其免疫保护效果。【方法】诱导表达FnbpA,经组氨酸标签亲合纯化后用Bradford法测定纯化的目的蛋白的含量,并检测其黏附活性及对动物的安全性。制备FnbpA亚单位疫苗,经无菌检验及安全检验后,进行免疫保护试验,用ELISA方法检测被免疫小鼠血清中的抗体效价,通过腹腔攻毒试验检测疫苗的免疫保护力。【结果】纯化的目的蛋白在80 ku处出现单一条带,蛋白质量浓度为0.245 mg/mL。细菌黏附抑制试验发现,经FnbpA蛋白预处理过的MDBK细胞黏附的金黄色葡萄球菌数较对照极显著减少;动物安全性试验显示,小鼠注射FnbpA亚单位疫苗后均健活,表明制备的FnbpA亚单位疫苗安全性良好。所有免疫组小鼠于首免后7 d即可在血清中检测到特异性抗体,抗体效价逐渐上升,在21 d达到最高值,之后逐渐降低。【结论】纯化的FnbpA蛋白达到了电泳级纯度,且依然保持良好的黏附活性;制备的FnbpA亚单位疫苗作用机体产生的抗体水平符合抗体消长规律,且表现出良好的免疫保护力。

牛源金黄色葡萄球菌FnbpA-A基因克隆及抗原表位预测

据GenBank上公布的金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A(fibronection-binding protein A,FnbpA)基因序列,设计1对引物特异性扩增FnbpA基因A区(FnbpA-A),然后对其进行克隆、测序、蛋白二级结构分析及抗原表位预测。结果表明,FnbpA-A基因全长1645bp,编码548个氨基酸,与金黄色葡萄球菌CIG1835株同源性达100%;该蛋白含α螺旋13.69%、β折叠30.84%、β转角11.86%和无规则卷曲43.61%;B细胞表位可能位于N端31—46、54—69、142—157、303—318、324—339、450—465、491—506和533—548区段;T细胞表位可能位于N端353—361和245—253区段。综上所述,FnbpA-A可作为后续金黄色葡萄球菌基因工程亚单位疫苗候选基因筛选区域。

重组牛乳源金黄色葡萄球菌黏附因子FnbpA A功能区的表达与鉴定

黏附素分子FnbpA（纤连蛋白结合蛋白A，fibronectinbindingproteinA）是金黄色葡萄球菌感染早期最重要的致病因子，也是一个重要的免疫靶标。由于不同地区流行的菌株产生的黏附素有一定的差异，将分离自新疆地区奶牛乳源金黄色葡萄球菌黏附素分子FnbpA的A功能区亚克隆至pGEX原核表达载体并转入BL21中诱导表达，SDS—PAGE分析表明，切除GST标签后在63kD处出现特异性条带。纯化切除GST标签的蛋白经弗氏佐剂乳化免疫试验兔。ELISA方法检测免疫兔的抗体效价并评估抗体和葡萄球菌结合能力，结果表明，目的蛋白的抗体效价可达6．7×10^6，并可在体外识别菌体抗原。

新疆奶牛乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌FnbpA基因的克隆与序列分析

采集新疆奶牛隐性乳腺炎乳样,经分离、鉴定,从中得到金黄色葡萄球菌,参考GenBank中发表的FnbpA基因序列,用Oligo 6.0软件设计一对特异性引物。提取分离株中的基因组DNA,经PCR扩增得到1 654 bp的目的片段FnbpA,将其插入PMD18-T克隆载体中构建PMD18-FnbpA重组质粒,将其转入到大肠杆菌DH5α中,并进行测序分析。结果表明,克隆的FnbpA基因片段全长1 654 bp,共编码314个氨基酸。分析表明,FnbpA蛋白基因潜在的蛋白质抗原决定簇有17个,抗原性很强,与16株FnbpA基因标准序列的同源性为77.1%-100%,本研究所克隆的FnbpA基因与AM990992株亲缘性最近。

金黄色葡萄球菌FnBPA D基因片段的表达

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要传染性病原菌。本实验采用分子克隆及蛋白表达技术,成功的表达了金黄色葡萄球菌纤维素结合蛋白A(FnBPA)D片段并对其免疫学活性进行了初步研究。表达产物免疫实验动物后,获得较高效价的抗体。用制备血清进行吞噬调理试验,抗金黄色葡萄球菌黏附等一系列试验,证明抗体对金黄色葡萄球菌具有吞噬调理作用,也有抗金黄色葡萄球菌黏附的作用,这将为制备奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌黏附素疫苗奠定基础。

基于金黄色葡萄球菌FnBPA和停乳链球菌GapC的多表位疫苗免疫原性研究

金黄色葡萄球菌和链球菌是奶牛乳腺炎的重要致病菌,为了研究预防金黄色葡萄球菌和链球菌感染的奶牛乳腺炎新型疫苗,以金黄色葡萄球菌FnBPA的1个CD4^(+)T细胞表位和两个B细胞表位构建了FTB1B2表位疫苗,以停乳链球菌GapC的1个CD4^(+)T细胞表位和两个B细胞表位构建了GTB1B2表位疫苗,再以GSGSGS作为Linker,串联FTB1B2与GTB1B2构建了表位疫苗FG;串联了FnBPA的CD4^(+)T细胞表位FT和GapC的CD4^(+)T细胞表位GT构建了表位疫苗FGT。通过免疫接种BALB/c小鼠评价疫苗的免疫原性。结果显示,FT、GT和FGT仅能诱导细胞免疫应答,并不能显著抑制金黄色葡萄球菌或停乳链球菌在肝、脾、肺、肾各器官的定殖数;FG诱导细胞和体液免疫应答能力显著高于GT、FGT和GST,显著低于FTB1B2和GTB1B2;FG免疫小鼠各器官细菌定殖数显著低于FT、GT、FGT和GST,显著高于FTB1B2和GTB1B2,但能够同时抑制金黄色葡萄球菌和停乳链球菌在各器官的定殖。结果表明,研究构建的FG表位疫苗能够诱导良好的免疫应答,并能同时抑制攻毒小鼠器官中金黄色葡萄球菌和停乳链球菌的定殖。

奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌FnBPA蛋白免疫研究

为了研究奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌发病机制和治疗措施,对引起奶牛临床型和隐性乳腺炎的337株金黄色葡萄球菌进行FnBPA蛋白基因分子调查,并且表达和纯化了FnBPA蛋白,制作FnBPA蛋白疫苗进行动物免疫试验。结果表明,FnBPA蛋白基因携带率为51. 04%,临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌FnBPA蛋白基因的携带率为68. 5%。选取分离菌株10A扩增出的FnBPA基因,进行原核表达,重组蛋白得到高效表达,获得高纯度的FnBPA蛋白,BCA法蛋白定量为2. 8 mg/mL,制作蛋白疫苗免疫3头试验奶牛,30～40 d后,ELISA检测血清抗体滴度达到高峰,最高抗体滴度达到7l og_2,该蛋白具有很好的抗原性。

FnBPA-A遗传多态性对牛源金黄色葡萄球菌与牛乳腺上皮细胞相互作用的影响

为研究FnBPA-A不同遗传多态性重组质粒抗血清对牛源金黄色葡萄球菌与牛原代乳腺上皮细胞粘附作用的影响。采集奶牛乳腺组织样品,用组织块种植法和胰酶消化法进行纯化和传代培养,并利用对乳腺上皮细胞特异性角蛋白18进行鉴定。将4株不同金黄色葡萄球菌分离株作用于纯化的乳腺上皮细胞,分析不同菌株粘附牛乳腺上皮细胞的能力。进而比较研究FnBPA-A不同遗传多态性重组质粒免疫后的抗血清对4株不同金黄色葡萄球菌分离株与牛乳腺上皮细胞粘附的抑制作用。结果表明,分离纯化获得了牛原代乳腺上皮细胞,分析了该乳腺上皮细胞的培养特性,不同金黄色葡萄球菌分离株对该细胞粘附的检测结果表明,4株不同分离株粘附牛乳腺上皮细胞的能力明显不同(P<0.05),其中GY278菌株粘附乳腺细胞的能力最强。FnBPA-A不同遗传多态重组质粒免疫后的抗血清抑制不同菌株粘附牛乳腺上皮细胞的能力也表现出明显的差异性,pV-819、pV-309、pV-20-2免疫组的抗血清对4株牛源金黄色葡萄球菌分离株的抑制作用高于其他免疫组。

牛源金黄色葡萄球菌不同遗传多态性FnBPA-A重组质粒的免疫生物学活性分析

为了解FnBPA-A分子遗传多态性重组质粒免疫后细胞免疫与体液免疫特点,以新疆不同地区分离的牛源金黄色葡萄球菌FnBPA-A真核重组质粒免疫小鼠,检测免疫后抗血清对不同金黄色葡萄球菌的识别能力,免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力,免疫血清中细胞因子IFN-γ与IL-4水平。结果表明,各免疫组抗血清对GY309菌株的识别能力较其他菌株弱。重组质粒pV-20-2、pV-801、pV-819、pV-856与pV-288刺激小鼠淋巴细胞增殖的能力及诱导IFN-γ水平明显高于其他各组。FnBPA-A分子的遗传多态性可以影响免疫小鼠免疫后抗体对菌体的识别及细胞免疫水平。

奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌ClfA A区和FnBPA基因的克隆与串联表达

金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的重要病原[1],近50%乳腺炎由该菌引起[2],主要感染乳房、乳头导管或损伤的乳头。致病性金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性较低,防治较难[3]。近年研究证实,在金黄色葡萄球菌感染早期,黏附素是最重要的致病因子,只有当金黄色葡萄球菌黏附到宿主细胞上,毒素和荚膜才能表达。与金黄色葡萄球菌在奶牛乳房中定植有关的黏附素主要是Clf A和Fn BPA。

组成型表达FnBPA的植物乳杆菌的构建及免疫初步评价

为了构建侵入型乳酸菌,将来源于金黄色葡萄球菌的侵入型蛋白FnBPA基因插入乳酸菌-大肠杆菌穿梭表达载体pOri23中,构建pOri23-FnBPA质粒,并通过电转化的方法将其电转到植物乳杆菌NC8中,通过Western-blot检测FnBPA蛋白的表达情况.结果表明目的蛋白FnBPA在组成型启动子Pori23作用下成功表达于NC8细菌表面.重组菌免疫Balb/c小鼠后,以流式细胞术检测了脾脏中树突状细胞数量,发现该重组菌可显著增加脾脏中CD11c＋树突状细胞数量,为后期乳酸菌侵袭细胞试验奠定了基础.

金黄色葡萄球菌黏附素ClfA,FnBPA-A,FnBPA-BCD联合免疫的免疫生物学特性

【目的】为比较金黄色葡萄球菌黏附素分子聚集因子(Clf A)与纤连蛋白结合蛋白A(Fn BPA)A区(Fn BPA-A)及BCD区(Fn BPA-BCD)的抗原性、抗体的黏附抑制特性及其免疫保护力。【方法】分别表达了Clf A蛋白、Fn BPA-A和Fn BPA-BCD蛋白,并将表达纯化后得到Clf A、Fn BPA-A和Fn BPA-BCD重组蛋白单独或联合免疫小鼠,收集免疫血清对其进行抗原性及免疫保护力的比较分析。【结果】结果显示,重组蛋白Fn BPA-BCD对Fn的结合能力高于其对Fg的结合,而重组蛋白Clf A及Fn BPA-A对Fg的结合能力高于Fn BPA-BCD。血清抗体的检测结果表明,Clf A蛋白及Fn BPA-A蛋白免疫组诱导抗体的水平均优于Fn BPABCD组。3种蛋白联合免疫组的血清抗体效价及抗体抗黏附能力明显优于单一蛋白免疫组(P<0.05)。3种蛋白联合免疫组与Clf A蛋白免疫组免疫保护率为100%,Fn BPA-A组与Fn BPA-BCD组免疫保护率分别为80%与50%。【结论】重组蛋白Clf A及Fn BPA-A的免疫原性优于Fn BPA-BCD,三者联合免疫较单一蛋白免疫在抗细菌的黏附、抗体诱导和免疫保护方面具有优势,提示这3种蛋白联合免疫有利于达到更好的免疫效果。

牛源金黄色葡萄球菌FnBPAA基因与D基因表达产物的免疫原性比较

为评价金黄色葡萄球菌黏附素蛋白FnBPA A和FnBPA D基因表达产物的免疫原性,分别用纯化的重组原核表达蛋白FnBPA A和FnBPA D免疫新西兰白兔,通过ELISA方法检测免疫家兔血清的抗体效价,用双抗体夹心法检测细胞因子的表达水平及进行全血调理吞噬试验。结果显示,在三免后第7天抗体水平分别可达1∶12 800(FnBPA A)、1∶25 600(FnBPA D),并且FnBPA A免疫组的全血杀菌能力优于FnBPA D免疫组;同时,两者均能提高家兔体内IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的表达水平,且FnBPA D组显著高于FnBPA A组(P<0.05)。结果表明,FnBPA D基因较FnBPA A基因更适合作为奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌基因工程亚单位疫苗的候选基因。

Kozak序列对金黄色葡萄球菌黏附因子FnBPA-A DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的影响

黏附因子FnbpA(纤连蛋白结合蛋白A,Fibronectin binding protein A)是金黄色葡萄球菌表面的蛋白质成分,是该菌感染早期最重要的致病因子,可促进其对寄主组织的侵入,也是一个有潜力的免疫靶标。将牛乳源金黄色葡萄球菌中FnBPA基因的A功能区克隆至真核表达载体中,分别构建含Kozak序列和不含Kozak序列的FnBPA-A基因真核表达载体,重组质粒经鉴定测序正确后,免疫C57BL/6小鼠检测其抗体水平和淋巴细胞增殖情况,并对各组小鼠进行攻毒实验。检测的结果表明Kozak修饰的重组DNA在血清抗体效价(P<0.05)和免疫保护率方面均优于不含Kozak序列的重组DNA,在刺激淋巴细胞增殖方面Kozak修饰的重组DNA的刺激效果虽然也高于不经修饰的重组DNA,但是差异不显著(P>0.05)。根据总体的免疫效果来看,Kozak序列对增强FnBPA的重组DNA疫苗诱导的免疫应答起了不容忽视的作用。

金黄色葡萄球菌FnbpA免疫优势片段的构建及免疫保护性研究

目的构建金黄色葡萄球菌FnbpA蛋白免疫优势片段原核表达菌株并研究其重组蛋白免疫原性。方法根据预测确定N区优势片段,通过聚合酶链反应(PCR)法对目的片段进行基因扩增,转入表达载体pET-32a,并导入宿主菌大肠杆菌(E.coli)Rosstta中进行原核表达;将N区优势片段与重复区优势片段通过重叠延伸聚合酶链反应(overlap PCR)融合,原核表达;将蛋白FL纯化,分别免疫Balb/c小鼠,并检测小鼠IgG水平、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、免疫保护率。结果各重组蛋白在E.coli Rosstta中均获得表达,表达后FnbpA 301-430aa、FL蛋白大小分别约39.3×103,49.1×103;抗体水平检测结果表明重组蛋白FL抗体水平接近全蛋白FnbpA,高于FnbpA 301-430aa;重组FL组淋巴细胞分泌IL-4、IFN-γ、IL-17的能力与FnbpA 301-430aa比较差异有统计学意义(P<0.05);攻毒结果表明,全蛋白FnbpA实验组免疫保护性最好,FL实验组保护性效果优于FnbpA 301-430aa。结论成功构建了金黄色葡萄球菌FnbpA免疫优势截短体蛋白的原核表达菌株,重组蛋白FL具有良好的免疫保护性。

牛源金黄色葡萄球菌FnBPA-A分子不同遗传多态性重组质粒的免疫生物学特性的比较

【目的】为了解Fn BPA-A分子遗传多态性对新疆部分地区牛源金黄色葡萄球菌免疫生物学特性的影响。【方法】对采自新疆不同地区的牛源金黄色葡萄球菌Fn BPA-A氨基酸序列进行分析,构建了Fn BPA-A 8个不同遗传多态性的真核重组质粒,分别免疫C57BL/6小鼠,收集免疫后的抗血清。对不同重组质粒免疫小鼠后免疫保护力进行比较分析。【结果】进化树显示GS801、GS819、GS856属于同一分支,GW10-1、GW20-2、GY288、GY309为同一分支,GY278为一分支。免疫小鼠并进行攻击保护检测,GW20-2、GS801、GS819、GS856与GY288免疫组对小鼠的免疫保护率较高,GY278免疫组免疫保护率最低。【结论】Fn BPA-A分子的遗传多态性可以影响免疫小鼠的免疫水平和攻毒保护力。

表达结核分枝杆菌ESAT-6-Ag85A基因的侵入型乳酸菌免疫特性研究

目的:研究表达ESAT-6-Ag85A(ES85A)融合基因的侵入型乳酸菌对小鼠体内免疫特性的影响。方法:将真核表达载体p Valac与ES85A连接构建真核表达质粒,并将其分别电转到重组乳酸菌NC8-pSIP-409和NC8-pSIP-409-FnBPA感受态中,构建双质粒的乳酸菌p Valac-ES85A/409和p Valac-ES85A/Fn BPA。将其免疫BALB/c小鼠,检测表达ES85A的侵入型乳酸菌对小鼠树突状细胞(DCs)亚群CD80和CD83的影响以及血清中细胞因子的表达水平。结果:Western blot和免疫荧光证明ES85A蛋白成功表达;与空载体组相比,在小鼠免疫表达ES85A的侵入型乳酸菌后,小鼠脾细胞中CD11^+CD80^+(P<0. 001)和CD11^+CD83^+(P<0. 01)以及血清中细胞因子IL-4(P<0. 05)的表达都有所增加。结论:表达ES85A的侵入型乳酸菌能促进小鼠体内DCs的分化和成熟以及提高血清中细胞因子IL-4的表达,为后期研制抗结核分枝杆菌的DNA疫苗制剂奠定了基础。

表面展示柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白的侵入型乳酸菌的免疫特性研究

为了研究表达pgsA′-EtMIC2融合蛋白的侵入型乳酸菌的免疫特性,将pgsA′-EtMIC2基因片段插入到载体pSIP409-FnBPA中,得到pSIP409-FnBPA-pgsA′-EtMIC2重组质粒,并用电转化的方式转入植物乳杆菌NC8感受态细胞中,构建表面展示EtMIC2蛋白的侵入型乳酸菌。通过检测免疫雏鸡外周血淋巴细胞中CD3^+CD4^+、CD3^+CD8^+T淋巴细胞的发育情况,血清中EtMIC2抗体、IL-4、IL-18、IFN-γ的含量以及肠道灌洗液中IgA的分泌量来评价该侵入型乳酸菌对雏鸡的免疫特性。结果显示,成功构建出携带pSIP409-FnBPA-pgsA′-EtMIC2质粒的重组乳酸菌;雏鸡免疫后外周血淋巴细胞中CD3^+CD4^+、CD3^+CD8^+T淋巴细胞含量明显升高;EtMIC2抗体、IL-18、IFN-γ细胞因子及IgA产生的水平均显著上升,表明该侵入型乳酸菌具有一定的免疫效力,为后期研究抗球虫的免疫保护效果奠定了基础。