基于Fosmid文库筛选山羊瘤胃微生物源蛋白酶基因及其表达验证

【目的】利用Fosmid文库功能筛选法,获得山羊瘤胃微生物源蛋白酶基因并进行原核表达。【方法】利用功能底物筛选法从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选具有蛋白酶活性的克隆子,对其进行Illumina二代测序,对预测到的基因进行功能注释,根据基因丰度结果确定后续研究的功能基因。利用大肠杆菌BL21(DE3)对功能基因进行诱导表达,对表达产物进行酶活性测定。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,将密码子优化后的功能基因分别敲入枯草芽孢杆菌C6基因组ctc位点并进行表达验证。【结果】从Fosmid文库1700个克隆子中筛选到1个具有蛋白酶活性的阳性克隆Pro4-C5。通过二代测序技术,鉴定出3个潜在的蛋白酶基因gene0833(内肽酶,EC编号:EC3.4.21.53)、gene0196(金属内肽酶,EC编号:EC3.4.24)和gene0585(羧肽酶,EC编号:EC3.4.17.14)以及1个L-天冬酰胺酶基因(gene0683,EC编号:EC3.5.1.1)。以pET-28a(+)为表达载体,通过大肠杆菌BL21(DE3)原核诱导表达发现,gene0585和gene0196未表达;gene0833表达的蛋白分子质量为87 ku,蛋白酶活性为10.45 U/mL;gene0683表达的蛋白分子质量为37 ku,L-天冬酰胺酶活性为88.52 U/mL,同时发现该蛋白也具有蛋白酶活性,酶活性为5.25 U/mL。将密码子优化后的gene0683和gene0833定点敲入枯草芽孢杆菌C6基因组中表达发现,gene0833未表达,gene0683表达的蛋白酶活性为109.72 U/mL,相比原始菌株(100.97 U/mL)显著提高了8.67%(P<0.01);L-天冬酰胺酶活性为31.63 U/mL,相比原始菌株(22.79 U/mL)显著提高了30.06%(P<0.01)。【结论】从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选和鉴定出了2个具有蛋白酶活性的功能基因(gene0833和gene0683),均来源于微小杆菌属(Exiguobacterium),其中gene0683在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达产物具有较高的蛋白酶和L-天冬酰胺酶酶活性。

基于Fosmid文库筛选山羊瘤胃源酯类水解酶基因及其原核表达验证

试验旨在挖掘瘤胃微生物中潜在的酯类水解酶基因并进行原核表达,研究其酶学性质及对芥子碱的降解效果。利用功能筛选方法,从前期构建的山羊瘤胃微生物Fosmid文库中鉴定出潜在的酯类水解酶基因,并在大肠杆菌中异源表达,通过酶活测定及芥子碱的降解研究来筛选功能酶,最后分析酯类水解酶的酶学性质。结果表明:从山羊瘤胃微生物Fosmid文库中鉴定到6个酯类水解酶基因Estg1、Estg2、Esty1、Estp、Estk1和Estk2,并在E.coli BL21(DE3)中成功表达,获得的酯类水解酶的活性均高于空载对照(P<0.05),其中Estp和Estk1的活性最高,分别为205.33 U/mL和212.67 U/mL,其分子量为33、28 ku,且能够降解芥子碱,降解率分别为13.26%和11.66%;酯酶Estp和Estk1在温度为40℃、pH 11时活性最高,在40~50℃、pH8~11条件下相对稳定;金属离子Mn^(2+)和Ni^(2+)对酯酶Estp和Estk1的活性有促进作用(P<0.01),有机溶剂正己烷能增强其活性(P<0.05);而EDTA、金属离子Cu^(2+)、Zn^(2+)、Co^(2+)和Fe^(3+)、有机溶剂乙腈以及表面活性剂吐温-80和曲拉通X-100会抑制Estp和Estk1的活性(P<0.01)。本研究从山羊瘤胃宏基因组文库中筛选了2个高产酯类水解酶的基因,异源表达后具有嗜中温、耐碱、耐有机溶剂等特性,且能够降解芥子碱,可为酯类水解酶的深入挖掘及应用提供理论依据。

西藏米拉山高寒草甸土壤微生物DNA提取及宏基因组Fosmid文库构建

青藏高原土壤中富含特殊的微生物资源,因大多数未能得到培养而无法利用.提取微生物总DNA及构建宏基因组文库的方法是研究未培养微生物的重要方法(免培养法).西藏米拉山高寒草甸土壤中腐植酸、有机质含量非常高,DNA提取非常困难,本研究表明直接法提取该样品的DNA片段小,杂质含量高,不能满足构建大插入片段文库的要求;结合低速离心和Nycodenz密度梯度离心先分离出微生物细胞的间接法虽然DNA产率降低,但是纯度高,片段长,多样性丰富,更适合于构建大插入片段文库.在间接法提取高质量西藏高寒草甸土壤微生物DNA的基础上,成功构建了一个包含30624个克隆、库容量超过1Gbz稳定性好的宏基因组Fosmid文库,为从西藏高原土壤中挖掘和利用新的功能基因研究奠定了基础.

湖羊瘤胃微生物Fosmid文库的构建和分析

为了开发瘤胃微生物酶资源,本研究以湖羊瘤胃为对象,构建瘤胃微生物的Fosmid文库,并对其库容量、稳定性和功能性进行分析。文库共获得克隆12704个。通过XhoⅠ和BamHⅠ限制性酶切分析发现,文库插入片断平均为30.9kb(17～55kb),主要集中于36～40kb和26～30kb2个区间;所建文库容量为393Mb。HindⅢ限制性分析证实,在连续传代100次时,文库仍保持很好的稳定性。通过刚果红染色分析获得18个具有木聚糖酶活性的阳性克隆。上述结果表明该文库具有较好的库容量、稳定性和功能性,可用于后续酶资源开发。

栉孔扇贝Fosmid文库的构建及基因组结构特征分析

研究构建第一个栉孔扇贝的fosmid基因组文库,该文库包含133 851个克隆,插入片断平均长度为40 kb,覆盖栉孔扇贝基因组的4.3倍。栉孔扇贝DNA在fosmid传代中表现得较为稳定,没有发现插入片段的丢失或重排。所有的克隆进行了超级池和二级池的构建,并筛选了2个基因和7个微卫星,结果阳性克隆数介于2到8之间。由此可见,该文库可以很好的用于目的基因或标记的筛选,将有利于物理作图和基因的图位克隆研究。2 016个克隆进行双末端测序,获得3 646条序列。序列总长2 286 986 bp,大约占栉孔扇贝基因组的1.84‰。共得到2 500条串连重复序列,其中微卫星序列371条,小卫星序列1 816条,卫星序列313条。共得到317条散布重复序列,总长97 412 bp,占测序总长的4.26%。查找到的散布重复序列共有4种类型:DNA转座子、LTR反转座子、LINE反转座子和滚环转座子,其中LINE反转座子的数目最多。BLAST比对共有1 383条序列与数据库现有的序列有明显的相似性(E<e-5),占测序总数的37.93%。BLASTN比对有明显相似性的1 036条序列中,与nr数据库序列相似的有113条,与EST数据库序列相似的有923条。BLASTX比对有明显相似性的序列有347条,占序列总数的9.52%。

荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组Fosmid文库的构建与分析

采用包埋法提取荷斯坦奶牛瘤胃微生物大片段总DNA,纯化后脉冲场电泳回收大小为36-48 kb,与pcc2FOS vector连接,转染至大肠埃希菌EPI 300宿主细胞,构建瘤胃微生物Fosmid基因组文库。对文库进行鉴定,该文库平均插入片段大小约35 kb,共保存30 000个克隆,空载体率小于2%,库容达1050 Mb。

红曲菌Fosmid文库的构建与分析

采用低熔点琼脂糖包埋红曲菌细胞核制成胶块,然后利用蛋白酶K消化被包埋的细胞核,纯化胶块里的大片段DNA,随机剪切法回收40 kb左右的DNA,与Fosmid载体连接,经包装、转染构建红曲菌的基因组Fosmid文库,库容量为3×104,平均插入片段长度为36.6 kb.将其中7 700个单克隆保存于21块384孔微孔板中,-80℃储存.该文库符合黏粒文库的品质要求,为克隆聚酮化合物基因簇或其他重要基因及其功能的研究奠定了基础.

雷蒙德氏棉叶绿体基因组Fosmid文库构建

采用高盐、低pH值法提取雷蒙德氏棉叶绿体DNA;通过物理剪切法获得随机断裂的DNA片段;剪切片段末端、补平修饰后与pCC1FOS载体连接;用噬菌体包装蛋白包装重组DNA,侵染大肠杆菌EPI300,构建了雷蒙德氏棉叶绿体基因组文库。对于叶绿体DNA剪切,以1 mL注射器中等速度吸打18次为最佳参数。叶绿体基因组Fosmid文库滴度为1×104 cfu.mL-1,插入片段大小平均为38 kb,最终筛选出39个克隆用于后续研究,覆盖叶绿体基因组9.2倍。以叶绿体特异标记筛选出能够覆盖雷蒙德氏棉叶绿体全基因组的6个克隆:F66,F46,F28,F8,F55和F3,为基因组结构和功能基因分析提供了良好的基础。

武夷菌素产生菌Fosmid文库的构建及文库探针的获得

以不吸水链霉菌武夷变种CK-15为材料，提取基因组DNA，经Sau3AI部分酶切后回收35—40kb之间的片段。连接到pCC1FOS载体上，经过包装转染涂布后构建得到了CK-15基因组的Fosmid文库，文库的滴度为8．8×10^5CFU／mL。随机挑取16个阳性克隆，经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切电泳分析，样品插入片段平均长度大于35kh，插入率为100％，符合构建文库的要求。根据多氧霉素、尼克霉素生物合成基因及大环内酯类聚酮合成酶基因（PKS）设计特异性引物，以基因组为模板进行PCR扩增，筛选特异性引物探针。结果用大环内酯类聚酮合成酶基因设计引物扩增出1693bp的片段经Blast比对其与大环内酯类抗生素生物合成基因相似性为95％以上。武夷菌素产生菌CK-15 Fosmid文库的构建及文库探针的获得，为武夷菌素生物合成基因的克隆奠定了基础。

活性污泥宏基因组Fosmid文库的构建

大插入片段宏基因组文库的构建是开发大片段目的基因及分析其结构与功能的基础.文中分别采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、试剂盒及琼脂糖包埋法提取活性污泥宏基因组DNA,其中琼脂糖包埋法获得的DNA片段大于23kbp,利用此DNA成功构建了以pCC1FOS为载体的Fosmid文库,该文库含有5280个克隆,平均插入片段长度为35～40 kbp,共包含约200 Mbp的宏基因组DNA.从此文库中随机挑选200个克隆,利用活性筛选方法快速筛选到了1个含有淀粉酶的阳性克隆,表明活性污泥Fosmid文库可用于功能基因的活性筛选,具有开发新基因的潜力.

大腹圆蛛Fosmid文库的构建及MaSp基因筛选方法的探讨

介绍了构建大腹圆蛛Fosmid基因组文库及牵引丝蛋白(MaSp)基因克隆筛选的全过程.采用改良CTAB法提取大片段基因组DNA,通过自主构建的电洗脱核酸回收装置分离回收30～40kbDNA片段,经补平磷酸化、与pCC2FOS载体连接、体外包装和转染EPI300TM-T1R,首次构建了无偏向性的大腹圆蛛Fosmid文库,其滴度为4.5×105cfu/mL,覆盖基因组倍数为10.以α-32P标记寡核苷酸探针对文库进行初步筛选,获得含MaSp基因的12个阳性克隆.该文库符合Fosmid文库的品质要求,为进一步筛选并研究大腹圆蛛MaSp基因序列奠定了基础.

云南大额牛瘤胃宏基因组Fosmid文库的构建与分析

为研究云南大额牛瘤胃中丰富的降解纤维素类物质的基因，采用包埋法和脉冲场电泳技术直接从云南大额牛瘤胃内容物提取总DNA，经不完全酶切获得DNA片段，大小为23-48 kb，与pcc2 FOS vector连接，转化至E.coli EPI 300宿主细胞，构建瘤胃微生物宏基因组Fosmid文库。该文库共保存38400个克隆，平均插入片段大小约35.5 kb，空载率小于2%，库容达1363 Mb。通过对该文库进行部分纤维素酶活力筛选，获得具有羧甲基纤维素酶活性的克隆95个，木聚糖酶活性的克隆52个，同时具有这2种酶活性的克隆23个，这为进一步研究大额牛瘤胃内纤维素酶基因奠定了基础。

杂色鲍Fosmid基因组文库构建与血蓝蛋白基因筛选

以杂色鲍Haliotis diversicolor肌肉组织为材料,按照CopyControlTM Fosmid Library Production Kit中方法构建了杂色鲍Fosmid全基因组文库.从文库中随机挑取50个克隆进行NotⅠ酶切鉴定发现,阳性率达到100%,插入片段大小分布在32～48 kb之间,平均长度约37.6 kb.随机挑取8个克隆进行正、反向末端测序,获得了全部16个测序结果,其中8条序列确定为鲍来源基因序列.进一步根据杂色鲍血蓝蛋白(Hemocyanin)基因3'端序列设计特异引物,用PCR方法对基因组文库进行筛选,获得一个阳性克隆,经Primer-Walking测序、Blast比对和进化分析证实,该序列为杂色鲍血蓝蛋白Ⅱ型基因克隆.

条斑紫菜基因组Fosmid文库构建

高分子量基因组文库是开展条斑紫菜基因组学研究的必备工具。构建了由23 040个Fosmid克隆组成的条斑紫菜孢子体无偏倚基因组文库。检测分析表明：文库克隆重组率为100%；插入DNA片段长度为28-40 kb，平均长度为35 kb，文库覆盖率约为条斑紫菜基因组的2.78倍；从超级池中筛查条斑紫菜18S rRNA、atpA、h2A、rbcL基因，至少能得到一个阳性克隆，印证了计算所推测的文库覆盖率；随机选取6个Fosmid克隆经100代传代后插入DNA片段未发生丢失或长度变化，表明克隆传代的稳定性。该文库的构建为开展条斑紫菜基因组特性分析和基因克隆奠定了基础。

甘薯近缘种Ipomoea trifida (Kunth) G.Don基因组Fosmid文库构建及PCR筛选体系建立

为挖掘有价值的基因资源,对甘薯近缘种I.trifida的基因组文库进行了研究。通过流式细胞法测定I.trifida（2x,编号DLP4597）基因组大小为531.699 Mb。以叶片为材料采用包埋法提取基因组DNA,通过物理剪切进行基因组DNA片段化并进行末端平滑化和磷酸化处理,脉冲场电泳回收33-48 kb的DNA片段,然后连接到Fosmid载体pCC1FOS（Epicentre）上,包装转化大肠杆菌EPI300,构建了I.trifida的基因组Fosmid文库,该文库包含101 952个单克隆,保存于1 062个96孔培养板中,平均插入片段35 kb,覆盖基因组约6.7倍,理论上任意片段筛出率达到99.88%。以20个96孔板为一组构建三维PCR筛选体系,共分为53个组（第53组包含22个96孔板）,每组包含1个超级池,20个板池,12个列池,8个行池,理论上最多通过93个PCR反应即可筛选到1个阳性单克隆。随机选择来自I.trifida的10个基因进行文库克隆筛选,平均阳性克隆数为8.2个,最少阳性克隆数为3个,最多为16个。

Fosmid基因组文库构建及应用现状

稳定的大片段基因组文库是生物基因组学研究的基础材料平台。近年来Fosmid载体由于其插入片段大小适中、易于构建、稳定性好、拷贝数可诱导等优点,越来越广泛地被应用于物理作图、基因挖掘、辅助测序等工作。本文就Fosmid克隆载体发展历程、Fosmid文库的功能及其在各领域的应用现状、发展前景等方面展开论述,主要呈现构建Fosmid基因组文库的作用及应用现状。

长雄野生稻(Oryza longistaminata)全基因组Fosmid文库构建

长雄野生稻（0．10ngistaminata）起源于非洲，具有和亚洲栽培稻相同的AA基因组，是栽培稻改良的重要遗传资源。本研究构建了长雄野生稻全基因组fosmid文库，共获得33．6万克隆，文库的平均插入片段大小约为40kb，其中94．7％的克隆插入片段大小在30～50kb之间。挑取其中约11万克隆并保存，可覆盖10倍栽培稻基因组，对任意基因或序列的筛选概率达到了99．99％。将剩余的22万个克隆进行了末端配对测序，显示其有助于长雄野生稻全基因组测序的拼接。所构建的fosmid文库为筛选和克隆长雄野生稻的有利基因提供了研究材料。

家猪Fosmid基因组文库的构建

本研究采用蛋白酶K和苯酚抽提法提取基因组DNA，通过物理方法随机剪切DNA，经T4DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶末端修饰，琼脂糖凝胶电泳回收大小为25-40kb的片段，与pCC1FOS载体连接，噬菌体包装蛋白体外包装，转染大肠杆菌EP1300，构建了家猪Fosmid基因组文库。文库容量为8．50×10^9CFU／ml，平均插入片段大小约25kb，用家猪MC1卫星DNA做探针对文库进行初步筛选，获得含该卫星DNA的阳性克隆，该文库的构建为进一步筛选并研究猪卫星DNA序列奠定了基础。

黄淮白山羊瘤胃微生物Fosmid文库的构建与分析

采用CTAB法和蛋白酶K法提取黄淮白山羊瘤胃微生物总DNA,酶切获得DNA片段,大小为23～50 kb,以E.coli EPI300为宿主细胞,构建瘤胃微生物宏基因Fosmid文库。研究发现该文库共获得克隆28 800个,插入片段大小约35 kb,空载率小于2%,容量1 008 Mb。通过羧甲基纤维素酶和木聚糖酶(Xylanase)活性筛选,分别获得具有两种酶活性的阳性克隆60和32个,木聚糖酶和羧甲基纤维素酶(CMC,Carboxymethyl cellulase)共同作用阳性克隆15个。通过已测序MF3木聚糖酶阳性克隆酶学活性分析,该木聚糖酶在最适应pH 4.5, 40℃条件下,酶活力为79.287μ·mL^(-1)。为进一步研究黄淮白山羊瘤胃内纤维素酶(Cellulase)基因奠定基础。

盐湖微生物Fosmid文库纤维素酶克隆的筛选及产酶研究

利用平板影印法,从陕西花马盐湖沉积物微生物免培养Fosmid文库4 126个克隆中,筛选到具有羧甲基纤维素酶活性的克隆17个。以纤维素酶活性较强的YH-13号克隆为出发菌株,研究其产酶条件。结果表明,以麦芽糖为最适碳源,以硫酸铵为最适氮源,最适p H值为4.5,最适发酵时间为2 d,最适产酶温度为37℃时该酶活性最高。这为进一步研究利用极端盐湖沉积物微生物纤维素酶基因奠定了基础。