姜曲海猪FoxO3 基因组织表达和多态性与肉质关联分析

为研究姜曲海猪FoxO3基因组织表达和遗传多态性与肉质性状的关联性,采用PCR-SSP分子标记技术,分析了112头姜曲海猪FoxO3基因第二外显子的遗传变异情况,利用实时荧光定量PCR检测姜曲海猪心脏、肝脏、脾脏、肾脏、腹脂、皮下脂肪、背最长肌、比目鱼肌、腓肠肌和半腱肌中FoxO3基因的表达量。姜曲海猪FoxO3基因第二外显子500 bp位点存在多态性,得到TT、CC及TC 3种基因型,T基因频率为0.424,表现为中度多态(PIC=0.369);试验猪群的基因频率和基因型频率都处于哈迪温伯格平衡状态(P>0.05);分析不同基因型对肉质性状的影响,FoxO3基因第二外显子多态性与猪肌内脂肪含量、剪切力性状关联显著。FoxO3基因在姜曲海猪10个组织中均有表达,FoxO3基因与肌纤维直径和肌内脂肪含量呈负相关,与肌纤维密度和剪切力呈正相关,但相关性均不显著(P>0.05)。FoxO3基因与腓肠肌肌原纤维直径相关系数分别为-0.937,与背最长肌肌节长度的相关系数为-0.874。综上,FoxO3基因对姜曲海猪肉质性状发育有一定的影响,可作为肉质性状候选基因进行深入研究。

人FOXO3a基因真核表达载体的构建及其功能验证

目的:构建带myc标签的人FOXO3a基因真核表达载体,并对其功能进行初步检测。方法:采用PCR技术,从乳腺文库中扩增人FOXO3a基因,并将其正确插入pXJ-40-myc载体;将重组质粒与空载体分别转染人乳腺癌细胞系ZR75-1、MCF-7后,通过Western印迹检测其表达情况,并用CCK8法测定细胞生长曲线。结果:双酶切和测序鉴定表明myc-FOXO3a真核表达质粒构建成功,转染乳腺癌ZR75-1、MCF-7细胞后目的基因成功表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-FOXO3a的乳腺癌细胞较空载体细胞生长较慢。结论:构建了带myc标签的人FOXO3a基因真核表达载体,为进一步研究FOXO3a在乳腺癌中的功能奠定了基础。

猪FOXO3基因的多态性和生长性状关联分析

为了探讨猪FOXO3基因SNPs位点及其与猪生长性状的关联性,采用基因克隆并测序的方法检测FOXO3基因的多态位点,并对其与生长性状进行关联分析。结果显示:该基因共存在3个SNP位点,为:G82316A、T60086C和A64011G,分别命名为:P1、P2和P3。在群体中均表现出3种基因型,3个位点对生长性状的影响表现为:P1位点AA基因型个体校正背膘厚显著高于AG基因型个体(P<0.05)以及GG基因型个体(P<0.05);P2位点CC基因型个体背膘厚显著高于TT基因型个体(P<0.05)以及TC基因型个体(P<0.05);P3位点AG基因型个体100 kg日龄显著低于AA基因型个体(P<0.05)以及GG基因型个体(P<0.05)。结论:P1、P2变异位点对大白猪的背膘厚及生长速度具有负选择作用,P3位点对大白猪的背膘厚和生长速度具有正选择作用。此3个多态位点可作为猪分子遗传育种的选择性标记。

FoxO3基因在膀胱癌中的表达、功能富集和信号通路生物信息学分析

目的:探讨叉头盒状O转录因子3(FoxO3)在膀胱癌中表达、相关生物学功能和信号通路以及与患者生存期的关系。方法:分析癌症基因组图谱数据库(TCGA)中膀胱癌患者的癌组织和正常膀胱组织中FoxO3基因表达水平。STRING数据库构建FoxO3基因相关蛋白-蛋白相互作用网络,对网络中的基因进行聚类分析,并采用cytoscape筛选网络中的关键基因。采用基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)对FoxO3和相关基因进行功能富集。Cox回归模型构建生存曲线,比较FoxO3高低表达组患者的总生存期(OS)和无疾病进展生存期(DFS)有无差异。结果:FoxO3表达水平在膀胱癌组织中表达水平显著低于对应的正常膀胱组织(P<0.05),而FoxO3表达水平在不同临床分期膀胱癌患者的癌组织中无明显差异(P>0.05)。FoxO3蛋白-蛋白相互作用网络中共有51个蛋白和587个相互作用关,各蛋白平均相互作用指数为23,网络中各个蛋白富集明显(P<1-16)。FoxO3基因表达与FoxO3B基因表达呈正相关(r=0.94,P<0.05),而与TIMM16基因表达呈负相关(r=–0.43,P<0.05)。FoxO3低表达组膀胱癌患者的总生存期(HR=1.4,P=0.029)和无疾病进展生存期(HR=1.5, P=0.015)显著高于高表达组。结论:FoxO3在膀胱癌患者肿瘤组织中表达水平明显下调,且FoxO3低表达与患者的预后不良有关。

FoxO3转录因子在鸡卵巢组织中的表达鉴定

【目的】明确FoxO3转录因子在不同日龄鸡卵巢组织中的表达模式及其具体定位情况,为后续开展家禽卵泡激活及发育调控等相关机理研究提供科学依据。【方法】在GenBank中搜索鸡与其他物种(鸭、鹅、老鼠、猪、牛及人类)的FoxO3氨基酸序列,通过LaserGene分析鸡FoxO3氨基酸序列与其他物种FoxO3氨基酸序列间的亲缘关系及同源差异情况;利用RT-PCR鉴定FoxO3基因是否在鸡卵巢组织中表达,再采用实时荧光定量PCR检测不同发育阶段鸡卵巢组织中FoxO3基因的表达水平,最后以免疫荧光检测FoxO3蛋白在鸡卵巢组织中的定位情况。【结果】鸡与鸭和鹅的FoxO3氨基酸序列相似性分别为92.7%和95.3%,基于FoxO3氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示鸡与鸭和鹅的亲缘关系较近,说明FoxO3基因的进化相对较保守。在不同发育阶段的鸡卵巢组织中均能检测到FoxO3基因表达,且FoxO3基因在0日龄鸡卵巢组织中的相对表达量最高,显著高于在其他发育阶段的相对表达量(P<0.05)。在0日龄鸡卵巢组织中未检测到FoxO3蛋白,但在21日龄和成年鸡的卵巢组织中均能检测到FoxO3蛋白;在21日龄鸡卵巢组织中FoxO3蛋白主要定位在原始卵泡细胞周围,在卵泡内部没有表达;而在成年鸡卵巢组织中FoxO3蛋白仅定位于大卵泡细胞边缘,小卵泡细胞内并未发现FoxO3蛋白。【结论】由于鸡和哺乳动物的FoxO3氨基酸序列高度同源,且FoxO3蛋白在鸡卵巢组织中的定位与在哺乳动物卵巢组织中的定位相似,说明FoxO3在鸡卵巢组织中发挥着与哺乳动物相似的功能,即在卵泡激活与成熟过程中发挥重要作用,因此通过调控FoxO3能有效提高鸡的繁殖性能。

新疆雪莲提取液预防小鼠卵巢早衰的初步研究

[目的]初步探讨雪莲提取液调控雌性小鼠生殖生理的机制,为天山雪莲作为女性美容保健用品以及临床预防和治疗妇科疾病提供理论依据。[方法]选择60只性周期正常的小鼠,随机分为试验组和对照组,每组30只;分别于每天12:00灌胃0.5 ml雪莲提取液和浓度0.9%生理盐水,采用阴道脱落细胞涂片观察小鼠性周期变化,并提取双侧卵巢组织RNA,采用RT-PCR分析卵巢中Pten和FoxO3基因的表达情况。[结果]试验组和对照组的小鼠性周期紊乱率分别为50.0%和76.7%;FoxO3和Pten基因在试验组小鼠卵巢中的表达优于对照组小鼠。[结论]雪莲提取液对连续光照造成的小鼠卵巢早衰现象有一定的预防作用。

FOXO3基因多态性与职业性噪声聋易感性的关系

目的探索FOXO3基因rs12212067位点的单核苷酸多态性与中国汉族人群噪声性耳聋易感性的关联。方法采用病例对照的研究方法，以江苏某大型化纤集团的1066例噪声暴露工人为研究对象，进行问卷调查并收集现场接触资料，同时抽取空腹外周静脉血2ml，根据纯音听力检查结果，将研究对象分为病例组（531人，双耳高频平均听阈〉25dB）和对照组（535人，双耳高频平均听阈≤25dB）。利用TaqMan探针法对FOXO3基因rs12212067位点进行基因分型。结果基因分型结果提示GT＋GG基因型是导致职业性噪声聋发病的危险性因素，调整OR值及其95％可信区间为2．044（1．51～2．78）。对噪声暴露强度分层分析后，噪声强度为≤85、85—92、〉92dB的调整OR值及其95％可信区间分别为2．43（1．52～3．90），2．17（1．03—4．59）和1．74（1．07-2．83）。结论FOXO3基因rs12212067位点的GT＋GG基因型可能是职业性噪声聋发病的危险因素。

mmu-miR-30b对鼠FoxO3 mRNA表达的影响

目的 探讨mmu-miR-30b与鼠FoxO3 （mFoxO3） mRNA的直接相互作用.方法 经生物信息学分析,利用特异性引物以及定点突变引物从鼠cDNA中分别扩增大小为402 bp、123 bp和299 bp的目的片段,并对123 bp和299 bp片段进行拼接,获得野生型、突变型mFoxO3 mRNA特异性片段,再分别与pmirGLO载体连接,构建野生型、突变型重组双荧光素酶报告基因质粒 （pmirGLO-mFoxO3、pmirGLO-mFoxO3 mt）;重组质粒与mmu-miR-30b/mmu-miR-30b inhibitor共转染至HEK293 T细胞,分析其荧光素酶活性;Western blot 分析mmu-miR-30b对mFoxO3翻译水平的调控作用.结果双酶切、琼脂糖凝胶电泳及测序技术结果显示pmirGLO-mFoxO3、pmirGLO-mFoxO3 mt被成功构建;共转染后,pmirGLO组、pmirGLO＋mmu-miR-30b组、pmirGLO＋mmu-miR-30b inhibitor组、pmirGLO-mFoxO3＋mmu-miR-30b组、pmirGLO-mFoxO3＋mmu-miR-30b＋mmu-miR-30b inhibitor组和pmirGLO-mFoxO3 mt＋mmu-miR-30b组的荧光素酶活性水平分别为13.18±0.97、14.35±0.99、12.46±1.20、9.55±1.11、13.71±0.89和10.99±0.92;与pmirGLO＋mmu-miR-30b组相比,pmirGLO-mFoxO3＋mmu-miR-30b组的荧光素酶活性被明显降低,差异有统计学意义（P〈0.05）,而pmirGLO-mFoxO3 mt＋mmu-miR-30b组的荧光素酶活性无明显改变,差异无统计学意义（P〉0.05）;与pmirGLO-mFoxO3＋mmu-miR-30b组相比,pmirGLO-mFoxO3＋mmu-miR-30b＋mmu-miR-30b inhibitor组的荧光素酶活性有显著性增高,差异有统计学意义（P〈0.05）.加强mmu-miR-30b的表达能够显著抑制mFoxO3蛋白的表达（P〈0.05）,而削弱mmu-miR-30b的表达则显著增加mFoxO3蛋白的表达（P〈0.05）.结论 mFoxO3 mRNA是mmu-miR-30b的靶基因,两者之间存在着直接相互作用.

神经元细胞氧化应激模型中FOXO3基因及其下游凋亡基因BIM表达研究

为了研究在小鼠神经元细胞氧化应激模型中FOXO3基因及其下游凋亡基因BIM的表达情况,并进一步探讨FOXO3基因在神经退行性疾病中的临床意义,试验利用H_(2)O_(2)构建神经元细胞氧化应激模型,通过Western-blot分析和细胞活力检测验证该模型,采用实时荧光定量PCR方法检测FOXO3基因及其下游凋亡基因BIM的相对表达量,利用Si-RNA干扰FOXO3基因及其蛋白的表达,并再次利用实时荧光定量PCR和细胞活力检测方法分析FOXO3基因表达量与细胞死亡的关系。结果表明:与正常神经元细胞相比,经H_(2)O_(2)处理的神经元细胞中Cleaved-Caspase3表达量明显升高,细胞活力显著降低(P<0.05),FOXO3基因(P<0.05)及其凋亡基因BIM(P<0.01)相对表达量上升,即成功构建出神经元细胞氧化应激模型;用Si-RNA技术进行干扰后,FOXO3基因及其蛋白的相对表达量明显下降,与仅用H_(2)O_(2)处理的神经元细胞相比,凋亡基因BIM的相对表达量显著下降(P<0.05),神经元细胞活力显著增加(P<0.05)。说明FOXO3基因及其下游凋亡基因BIM的表达在神经元细胞氧化诱导死亡过程中有重要的促进作用。