海南高隆湾红树林及其近岸海域沉积物的弗兰克氏菌(Frankia)多样性分布及其与环境因子的关系

弗兰克氏菌(Frankia)因其独特高效的固氮效率而备受关注,然而目前的研究还局限于陆地生境。基于nifH基因采用高通量测序对高隆湾红树林及其近岸海域沉积物的Frankia多样性进行分析,共获得261条属于Frankia的nifH序列,共11个OTUs,序列主要分布在红树林区样品,其中以角果木和红海榄为优势树种的红树林样品中序列较多,在潮间带样品中也有少量分布,海草区样品未检测到,序列在不同生境中的分布存在较大差异。OTU818在10个站位都有分布,说明OTU818代表的Frankia类群分布比较广泛,且为红树林沉积物的优势类群。系统进化分析表明Frankia与NCBI数据库中的Frankia基因序列在系统发育树上形成不同分支。通过Network分析Frankia与其他细菌类群的共发生关系,发现Frankia与来自Verrucomicrobia、Proteobacteria、Firmicutes、Cyanobacteria的多种固氮细菌类群存在紧密联系,表明Frankia在稳定红树林固氮细菌群落结构中起着重要作用。利用典范对应分析(canonical correspondence analysis,CCA)方法研究了环境因子对Frankia多样性分布的影响,表明盐度、As和Al是影响Frankia多样性分布的显著环境因子。通过这些结果对Frankia的生态分布及其与环境因子的关系有了新的认识,也为后续开发利用这类固氮能力更具优势的Frankia提供前期数据参考。

ARDRA对植物根瘤内共生放线菌Frankia多样性的研究

应用原核生物 16SrDNA特异性引物rD1和fD1,通过ARDRA (amplifiedribosomalDNArestrictionanalysis)法直接扩增自中国云南、东北地区赤杨属 3种植物和沙棘属 1种植物根瘤内FrankiaDNA ,得到一长约 15 0 0bp的扩增产物 .选用两种内切酶HaeⅢ、AfaⅠ联合对扩增产物进行酶切 ,得到稳定的酶切图谱 .将所测48个感染赤杨的Frankia样本区分为 3个不同的组 ,所测 43个感染沙棘的Frankia样本区分为 3个不同的组 .显示根瘤内Frankia存在丰富的遗传多样性 .

自然环境胁迫对旱冬瓜Frankia菌基因多样性的影响

利用rep-PCR方法,研究云南鸡足山及无量山不同生境下旱冬瓜根瘤内FraTdeia菌基因多样性及其变化,以了解不同自然环境胁迫对Frankia菌基因多样性的影响.结果表明,多样性随地域、海拔和坡向不同而变化.鸡足山Frankia菌基因类型比无量山丰富.鸡足山旱冬瓜根瘤内的Frankia菌在山底2 300 m处,Shannon指数平均为0.90;山顶海拔2 650 m以上,Shannon指数随之上升到1.33.南坡Frankia菌多样性高于北坡,表明多样性指数与环境胁迫大小成正相关.自然环境胁迫是产生和保持Frankia菌基因多样性的重要因子之一.

高黎贡山旱冬瓜Frankia的IGS PCR-RFLP分析

在云南省高黎贡山自然保护区海拔 1310～ 2 4 0 0m的范围内 ,采集 30个旱冬瓜根瘤样品 ,直接从根瘤中提取FrankiaDNA ,对其nifD nifK基因间隔区 (intergenicspacer,IGS)和 16S 2 3SrDNAIGS进行PCR RFLP分析 .结果表明 ,nifD nifKIGS的PCR产物长度差异很大 ,经HaeⅢ和AfaⅠ双酶切后 ,得到 15种酶切带型 ,检测到多种基因型的菌株同时与同一株宿主植物共生 ;16S 2 3SrDNAIGS的PCR产物长度相似 ,酶切后亦区分出 15种酶切带型 .通过对两个基因间隔区的PCR RFLP联合分析 ,发现高黎贡山旱冬瓜Frankia存在 2

Frankia菌侵染木麻黄与其共生结瘤程序

通过回接结瘤后定期制作半薄、超薄切片,在光学和电子显微镜下观察研究了分离自浙江省短枝木麻黄Casuarina equisetifolia根瘤的2株Frankia菌的侵染过程。结果表明:Frankia菌从根毛细胞侵入后向内部的皮层细胞延伸,受Frankia菌侵入的刺激,侵染的根毛细胞产生大量电子云密度不等的沉积物。沉积物包裹Frankia菌继续向内侵染,形成"侵染线"穿越细胞壁进入邻近细胞,最终到达根瘤。根瘤产生的时间程序为:接种6 d后Frankia菌已侵染根部细胞;接种12 d后形成了根瘤原基;15 d后根瘤原基的部分薄壁细胞被Frankia菌侵染后,转变为前根瘤;接种24 d后前根瘤进一步生长发育伸长,突出皮层后形成新根瘤并最终发育成成熟瘤。Frankia菌的整个侵染过程为:Frankia菌侵染→形成"侵染线"→形成"界面质"→穿壁→繁殖→泡囊→孢子。根瘤的发育可概括为:根瘤原基→前根瘤→成熟瘤。

广西杨梅根瘤Frankia菌的分离和培养特性研究

采用根瘤切片法从广西本地杨梅根瘤中分离获得3株内生菌,经镜检、革兰氏染色和BAP无氮培养基培养,证实这3株内生菌为Frankia sp.,分别命名为MF3、MF6和MF9。对这3株分离株在不同碳源、氮源和pH值的培养特性进行研究。结果表明,3株分离株在分别以吐温-80、葡萄糖、丙酸钠为碳源的BAP培养基上生长良好,3株分离株对琥珀酸钠的利用较差;适宜的氮源为酵母膏、酪蛋白和氯化铵,尿素的利用率低。3株分离株均适合在pH 5.5～6.5范围内生长,pH 7.0以上生长受到抑制。

沙棘属植物结瘤特性及Frankia根瘤菌分离

以4种沙棘属植物为材料,调查其在不同生境、不同季节的结瘤特点,研究弗兰克氏根瘤菌(Frankia)的特性。研究发现,同种沙棘在不同生境和同种生境不同季节,不同种的沙棘属植物在不同生境,以及同一生境不同季节的根瘤大小、形状、着生部位、颜色和结瘤率不同;植物分布海拔越高,瘤块和瘤瓣越小;4种沙棘中藏沙棘根瘤瘤瓣最大。根瘤经切片法分离培养后,从不同生境不同季节生长的4种沙棘属植物中共得到纯培养菌株53株,不同宿主中的Frankia根瘤菌种类不同,同一宿主中也存在不同种类的Frankia根瘤菌。

内蒙古沙棘共生菌Frankia的遗传多样性

利用RFLP分子标记方法,在自然条件下对内蒙古东、西部8个地点采集的24个沙棘根瘤样品进行沙棘共生菌Frankia的遗传多样性分析。结果表明,供试样品nifD-nifK基因间隔区(IGS)扩增片段的大小约1 100bp;不同样品的酶切图谱有明显差异;有些样品产生复合RFLP型,揭示在自然状态下不同基因型的Frankia菌株可共同侵染同一沙棘寄主。聚类分析显示,来源于相同地点和不同地点的根瘤样品内的Frankia菌株间均有遗传多样性;没有发现Frankia菌株遗传多样性的分布与采样地点有相关性。

应用ARDRA技术研究Frankia菌多样性

应用原核生物 16SrDNA特异性引物rD1和fD1,对分自 4个分类接种群的 12株纯培养Frankia菌总DNA进行扩增 ,得到 1条长约 15 0 0bp的扩增产物。选用 2种内切酶HinfI ,MspI对扩增产物进行酶切 ,得到稳定的酶切图谱。对图谱的分析结果表明 。

固氮放线菌Frankia与放线菌根植物共生进化的研究进展

固氮放线菌Frankia是能够诱导大范围的放线菌根植物(actinorhizal plants)产生根瘤放线菌.放线菌根植物是植物受Frankia侵染后能够形成根瘤的植物[1].目前,它们之间的进化研究虽然取得了很大进展,但是仍然存在许多不清楚的东西.本文根据最近对植物和Frankia系统进化研究成果、根瘤中放线菌Frankia的多样性研究情况,综述放线菌根植物和共生Frankia进化的研究进展.

Frankia基因组DNA提取及其PCR带型

本文采用溶菌酶法、CTAB法、微波（MW）法及CTAB＋MW法等4种方法提取Frankia菌CpIl基因组DNA。结果表明四种方式均可满足试验要求，其中以CTAB法及微波法最为有效。在比较提取方法与PCR带型间的关系中，发现提取上的差异不影响PCR带型的变化。

杨梅根瘤Frankia菌分离株的遗传多样性研究

对分离自杨梅根瘤的10株Frankia菌分离株进行表型特性研究,并用特异引物扩增其16SrD-NA,对扩增产物用2种限制性内切酶Hinf 和Hae 进行酶切后,分析酶切图谱.结果表明:这10株Frankia菌分离株不仅表型存在差异,而且其酶切图谱差异较大,说明其基因型也有差异.即使从同一株荸荠种杨梅根瘤中,不同时间分离获得的Frankia菌分离株,表型和基因型也存在较大的差异,可能属于不同的基因种群.无论是从菌株表型分析,还是PCR产物的RFLP分析,都表明从杨梅根瘤中分离获得的Frankia菌分离株存在着丰富的遗传多样性.

杨梅根瘤Frankia菌的分离和培养特性研究

从荸荠种杨梅根瘤中分离获得3个内生菌株,经显微镜检查、回接、固氮活性测定、革兰氏染色检测,证实这3个内生菌为3个Frankiasp.,分别命名为Mpc11、Mpc12、Mpa11,并对这3个分离株的培养特性进行了研究。结果表明,Mpc11、Mpc12、Mpa113个菌株的固氮酶活性分别为691nmol乙烯/mg蛋白.h、689nmol乙烯/mg蛋白.h和1039nmol乙烯/mg蛋白.h。适宜于在BAP(有氮)固体培养基、BM+NZ和FMS液体培养基上生长。且分别以葡萄糖、丙酮酸钠(含量均为1g/L)、吐温-20(含量为1mL/L)为唯一碳源或分别以酪蛋白水解物、酵母抽提物(含量均为0.5g/L)为唯一氮源的BAP培养基上生长良好;能利用丙酸钠,但利用率低;且均不能利用尿素。Mpc11和Mpa11分离株适宜于在pH5.5～6.5范围内生长,pH7.0以上则菌体生长受到抑制。

中国沙棘(Hippophae rhamnoides ssp. Sinensis)根瘤内Frankia菌的遗传多样性

为了研究中国沙棘亚种共生菌Frankia的遗传多样性,利用PCR-RFLP分子标记方法,对从青海西宁到内蒙古库伦17个地点采集的106个中国沙棘根瘤样品进行遗传多样性分析。供试样品nifD-nifK基因间隔区（IGS）扩增产物分别用3种内切酶（HinfⅠ、HaeⅢ和MboⅠ）酶切,共产生21条酶切谱带,其中17条为多态性条带,多态位点百分比（PPL）为80.99%,所有样品可被划分为9个基因型。结果表明中国沙棘根瘤内的Frankia菌有丰富的遗传多样性,土壤质量较好地点的丰富度高于土壤质量较差地点,海拔较高地区的丰富度高于海拔较低地区,多数地点至少有2种不同基因型的Frankia菌。聚类分析显示Frankia菌不同基因型间的遗传距离在4.88%～55.96%之间,它们在不同地点的分布是不均匀的,没有发现不同基因型菌间的亲缘关系与地点有相关性。中国沙棘根瘤中Frankia菌可分为两个基因型组,组内基因型分布比较一致,而组间有明显差异。

Frankia菌在非豆科放线结瘤植物根际内的存活与分布

提取Ｆｒａｎｋｉａ菌１６ＳｒＲＮＡ，制备具专一性的寡核苷酸探针，通过同源杂交，在人工接种的木麻黄根际内检测出痕量Ｆｒａｎｋｉｓ菌结果表明，Ｆｒａｎｋｉａ可在环境因子的作用下被动迁移不论接种点的位置如何，经６个月的时间稳定后，其分布状态基本相同。

长白山赤杨根瘤内Frankia的基因多样性分析

采集长白山自然保护区北坡东北赤杨、西伯利亚赤杨、色赤杨根瘤样品 2 1个 ,对根瘤内FrankiaDNA的 16S -2 3SrDNA和nifD -nifK两个基因间隔区段 (IGS)进行PCR -RFLP分析 ,研究其基因多样性。结果表明 :与赤杨共生的Frankia菌存在丰富的基因多样性 ,基因类型与宿主种型关系密切。东北赤杨对Frankia的特异性较高 ,与西伯利亚赤杨和色赤杨共生的Frankia菌有较近的亲缘关系。

利用rep-PCR研究云南尼泊尔桤木根瘤内Frankia基因多样性

利用rep-PCR指纹技术对云南5个地区的尼泊尔桤木根瘤内Frankia菌基因多样性进行研究,实验发现Frankia菌呈现丰富的基因多样性.所有71个样品被分为11种不同的基因类型.除高黎贡山外,不同地域都有某种基因型占优势,显示Frankia菌基因型与地域有紧密关系.所观察的5个地区中,高黎贡山Frankia菌基因型种类最多,多样性指数最高,基因多样性最为丰富.结合高黎贡山地理资料及其它生物多样性相关研究,推测与高黎贡山尼泊尔桤木共生的Frankia可能作为种储备库,为其它地区的寄主植物提供了祖先菌株.

Frankia菌的遗传多样性的RAPD研究

选用20个随机引物，对分自2个分类接种群的8株Frandia纯培养的总DNA进行随机扩增，其中引物OPW15和OPW16能扩增得到较为稳定的RAPD图谱．扩增产物分子量大都分布在0．5～4Kb之间．从稳定的RAPD扩增图谱看，Frankia菌间存在有丰富的遗传多样性；在选定适当引物情况下，能依据共同带将Frankia菌化归为同一分类接种群．

用REP-PCR DNA指纹鉴别Frankia菌

用4种方法提取CPI1菌基因组DNA，并进行了REP-PCR扩增，结果表明，提取方法不影响REP-PCR带型。对14株Frankia菌株作REP-PCRDNA指纹分析，并对之进行比较鉴别，证明REP-PCR指纹法能有效地实现菌株间的差异鉴别，其结果与DNA同源相关性所得结果具有良好的相关性。

盐胁迫对Frankia生长和生理生化特性的影响

研究了盐胁迫（10～50g·L^-1 NaCl）对从杨梅（Myrica rubra（Lour．）Sieb．et Zucc．]、木麻黄（Casuarina spp．）、桤木（Alnus spp．）和福建胡颓子（Elaeagnus oldhami Maxim．）根瘤中分离出的11株Frankia菌株的生长和生理生化特性的影响。结果表明，在离体培养条件下，分离自木麻黄和桤木根瘤的Frankia菌株耐盐性最强，其次是来源于福建胡颓子根瘤的Frankia菌株，而从杨梅根瘤中分离得到的Frankia菌株耐盐性最弱。在盐胁迫条件下，Frankia菌株的形态和生理生化特征也发生相应变化：孢囊和泡囊数量增加、菌丝变细或变粗、固氮酶活性增加、营养源利用率下降。